《Frontiers in Nanotechnology》：Biosynthesis of gold nanoparticles using Psilocybe cubensis extracts and their biostimulatory evaluation in Neuro2a cells
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绿色纳米技术在神经科学领域的应用为中枢神经系统疾病的治疗提供了创新性解决方案。本研究报道了利用产裸盖菇素真菌——裸盖菇（Psilocybe cubensis）提取物生物合成金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs），并评估其神经刺激潜力。
绿色纳米技术在神经科学领域的应用为中枢神经系统疾病的治疗提供了创新性解决方案。本研究报道了利用产裸盖菇素真菌——裸盖菇（Psilocybe cubensis）提取物生物合成金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs），并评估其神经刺激潜力。AuNPs通过HAuCl4的生物还原法合成，并采用紫外-可见光谱（UV-Vis spectroscopy）、透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared, FTIR）进行表征。理化结果表明，成功制备了平均直径为18.94 nm的单分散球形纳米颗粒，且具有高胶体稳定性（zeta电位：?31.0 mV）。FTIR分析提示，真菌代谢物构成了纳米材料的稳定有机冠层。利用IncuCyte?实时监测平台和三维全息断层显微术在Neuro2a（N2a）神经元模型中评估了其生物活性。研究识别出一种剂量依赖的毒物兴奋效应（hormetic response）：22.91至183.25 μg/mL浓度区间可显著促进细胞增殖和活力，且不引起形态学损伤；而≥733.0 μg/mL剂量则导致急性细胞毒性。三维全息断层成像证实，生物刺激处理（91.63 μg/mL）可促进具有活跃胞质突起的细胞表型，与神经突生长的早期阶段一致。综上所述，裸盖菇AuNPs构成了一种兼具神经保护与促增殖能力的纳米治疗系统，为未来在再生医学和神经康复领域的应用奠定了基础。
一、研究背景与意义
纳米技术作为在纳米尺度（1–100 nm）上理解和操纵物质的前沿领域，已在基因组学、工程学和医学中催生了众多创新应用。在生物医学纳米材料中，金纳米颗粒（AuNPs）凭借其优异的理化性质——包括生物相容性、尺寸与形貌可调性、表面功能化能力以及表面等离子体共振（SPR）特性——成为药物递送、生物传感、生物成像和组织再生领域的多功能平台。在神经再生领域，AuNPs已被证实能够促进神经突生长、调节神经元电活动、增强突触形成，并促进治疗药物跨越血脑屏障（BBB）的递送。其神经再生机制涉及多因素协同：通过抗炎信号调节免疫微环境、通过清除活性氧（ROS）激活神经保护通路，以及促进脑源性神经营养因子（BDNF）等神经营养因子的整合，后者对神经元存活、分化和突触可塑性至关重要。
真菌介导的纳米颗粒生物合成，即真菌纳米技术（myconanotechnology），已作为传统化学方法的可持续、可扩展替代方案而兴起，可避免有毒试剂和苛刻反应条件。真菌相较于其他生物系统具有关键优势：其胞外生物合成机制便于下游处理和纯化；其富含酶和代谢物的分泌组能够高效且可控地还原金属离子；其快速生长特性支持可重复的大规模生产。在具有生物合成和神经活性潜力的真菌属中，裸盖菇（Psilocybe cubensis）代表了真菌纳米技术与神经科学交叉领域的创新模型。该粪生担子菌具有丰富的生化特征，主要包含色胺类生物碱——特别是裸盖菇素（psilocybin）、裸盖菇辛（psilocin）、贝奥西汀（baeocystin）和aeruginascin——以及麦角硫因（ergothioneine），后者是一种具有高氧化还原电位和金属螯合能力的高效抗氧化剂，对Au3+的还原和纳米颗粒稳定均至关重要。这些代谢物作为纳米颗粒形成的生物合成剂和作为具有调节神经可塑性与突触重塑能力的神经活性化合物的双重生物学意义，使裸盖菇成为合成具有潜在双重功能的AuNPs的独特前景基质。
尽管真菌绿色合成和裸盖菇代谢物的神经活性潜力日益受到关注，但尚无研究系统比较不同真菌基质（子实体与菌丝体）对所得AuNPs理化性质的影响，也未评估其调节神经元细胞模型中增殖、活力和形态的能力。本研究正是针对这一空白展开。
二、研究内容与主要结论
研究人员开展了一项系统性的研究，旨在优化并表征利用裸盖菇子实体和液体菌丝体提取物生物合成的AuNPs，并评估其对N2a神经元细胞的生物刺激效应。研究首先通过ITS区域分子鉴定确认了所用生物材料的物种身份，随后比较了两种真菌基质在纳米颗粒合成中的表现，发现子实体提取物能够成功稳定AuNPs，而液体菌丝体提取物则因缺乏关键还原和稳定代谢物而导致胶体失稳和沉降。通过UV-Vis光谱、TEM、DLS、zeta电位和FTIR的系统表征，研究人员确认了平均直径18.94 nm的单分散球形AuNPs，其具有?31.0 mV的高胶体稳定性，且FTIR分析证实真菌代谢物——包括裸盖菇素——构成了纳米颗粒表面的有机冠层。在N2a细胞模型中，研究人员通过IncuCyte? S3自动活细胞成像平台和三维全息断层显微术，建立了完整的剂量-反应特征，识别出22.91至183.25 μg/mL的生物刺激浓度窗口和≥733.0 μg/mL的细胞毒性阈值。三维全息断层成像进一步证实，91.63 μg/mL的最优刺激剂量可诱导与神经突生长早期阶段一致的细胞形态表型。
三、主要关键技术方法
本研究采用了以下关键技术方法：利用CTAB法提取基因组DNA并进行ITS区域PCR扩增和测序，通过GenBank BLAST数据库确认物种身份；采用生物还原法合成AuNPs，以HAuCl4为前体，以裸盖菇子实体和液体菌丝体提取物为还原和稳定剂；利用UV-Vis分光光度法监测SPR带以实时追踪纳米颗粒形成和胶体稳定性；采用TEM进行形貌和尺寸表征，并通过ImageJ软件进行形态计量分析；利用DLS和激光微电泳测定水合粒径、多分散指数和zeta电位；采用FTIR光谱鉴定参与纳米颗粒形成和稳定的功能基团；利用IncuCyte? S3自动化平台对N2a细胞进行48小时实时活细胞成像，量化增殖、汇合度、细胞死亡和细胞偏心率五个指标；采用三维全息断层显微术（Tomocube系统）对活细胞进行无标记高分辨率形态学评估。
四、研究结果
8.1 分子鉴定：通过ITS区域（ITS1–5.8S–ITS2，586 bp）的BLASTn分析，所有最高匹配序列均显示100%查询覆盖率和100%一致性，E值为0.0，包括裸盖菇凭证标本RHP5203（KC669284.1）等多个数据库条目，序列已提交至GenBank（PZ851660），明确确认了用于纳米颗粒生物合成的生物材料的分类学身份。
8.2 生物合成参数优化：对于子实体提取物，4小时反应时0.3 mM HAuCl4被确定为最优前体浓度，产生以~550 nm为中心的清晰、窄且对称的SPR峰，吸光度为0.303 a.u.，对应单分散球形金属纳米颗粒的均匀成核。24小时时0.3 mM和0.5 mM条件的SPR带发生轻微红移至~560–580 nm，表明金属核的受控生长。相比之下，液体培养提取物在4小时显示0.5 a.u.的初始吸收带，24小时增至~0.75 a.u.，但随后完全丧失峰定义并发生宏观沉降，无法维持胶体稳定性。
8.3 综合理化表征与胶体稳定性：TEM证实了高度均匀、非聚集的球形金核，平均直径18.94 ± 5.28 nm。DLS测得Z-平均水合粒径为19.41 nm，与TEM核尺寸高度吻合，数学上证明了AuNPs在液体介质中呈单个、非聚集且完美分散状态。FTIR分析确认了以蛋白质肽键（Amide I at 1630 cm?1和Amide II at 1598 cm?1）、脂肪链（2926–2853 cm?1）和碳水化合物结构（1079–1027 cm?1）为主的复杂生物基质。关键的是，比较游离提取物与功能化AuNPs时，1598.16 cm?1信号（色胺衍生物的吲哚环）和1027.58–990.18 cm?1双峰（磷酸酯P–O–C伸缩）的持续存在，提供了裸盖菇素等关键神经活性生物碱仍为包裹金纳米颗粒的预组装生物冠层结构组分的直接光谱证据。这种致密、带负电的有机包膜是?31.0 mV高稳定zeta电位的直接原因。研究还解释了DLS获得的高多分散指数（PdI = 1.00）的表观悖论：DLS追踪所有光散射实体的布朗运动，包括粗提取物中高度多样的游离生物分子，这种多模态衰减曲线在数学上将PdI上限设为1.00，反而证明了完整生物刺激有机冠层的存在。
8.4 体外生物相容性与实时活细胞动力学：在1,250细胞/孔的低密度条件下，22.91和45.81 μg/mL浓度显著增强增殖速率，45.81 μg/mL在48小时终点经Dunnett检验验证具有统计学显著生物刺激增加（p = 0.0173），而≥366.5 μg/mL剂量诱导急性早期细胞死亡，733.0 μg/mL时死亡率达69.89%。在2,500细胞/孔的最优密度条件下，双相行为高度显著，22.91、45.81和91.63 μg/mL剂量均诱导相对细胞数显著增加，其中91.63 μg/mL成为最优神经刺激浓度，汇合度达到19.00%对对照组12.17%。在5,000细胞/孔的高密度条件下，生物刺激窗口扩展至22.91至183.25 μg/mL，诱导汇合度扩展至37%–40%对对照组~17%，且与对照组相比基础细胞死亡显著降低。在所有三种密度下，所有生物刺激剂量的细胞偏心率均保持在基线范围（~0.65–~0.80），而1,466.0 μg/mL最大剂量在48小时产生高度显著的选择性持续细胞球形度增加，作为慢性细胞骨架应激的形态学指标。
8.5 三维无标记形态学建模：三维全息断层成像显示，对照组细胞呈高密度、紧凑的细胞聚集体，形态高度黏附、圆形，极少外周突起。45.81 μg/mL剂量下细胞呈球形至轻微伸长结构，无结构改变迹象。91.63 μg/mL最优生物刺激剂量下，细胞从典型圆形神经母细胞形态转变为显著伸长、纺锤形和梨形形态，具有变薄的体细胞极，三维重建确认了从细胞体向多个方向主动延伸的清晰三维胞质突起，该伸长表型与活跃细胞延伸相关的细胞骨架重组过程形态学相容，对应神经突生成的初始阶段。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究的方法框架旨在应对纳米医学转化的关键挑战，同时确保高分析可重复性。选择裸盖菇生物合成路线而非传统化学方案，是基于真菌分泌组在建立稳定预组装有机生物冠层中的积极作用。通过比较成熟子实体和液体营养菌丝体，研究确认子实体中存在的复杂次级代谢物基质——特别是金属螯合抗氧化剂麦角硫因和色胺类生物碱——对于限制金属核生长（~18.9 nm）和赋予静电稳定性（zeta电位：?31.0 mV）不可或缺。研究还强调了实时动力学监测和三维全息断层成像在揭示细胞反应时间动态和识别从生物刺激（22.91–183.25 μg/mL）到急性细胞毒性（≥733.0 μg/mL）转变的精确浓度阈值方面的关键作用。
研究结论部分指出，本研究首次报道了利用产裸盖菇素真菌提取物绿色合成金纳米颗粒，并首次通过实时动力学监测和全息断层分析评估其神经元生物活性。结果揭示了22.91至183.25 μg/mL的稳健生物相容窗口，其特征为统计学显著的促增殖和促活力效应。考虑到功能化神经活性代谢物对TrkB受体具有纳摩尔级亲和力，该纳米材料被定位为未来神经康复和再生医学研究中极具吸引力的候选系统。该创新方法允许提出一种纳米生物技术系统，其中金属核作为稳定的载体，承载一组对脑治疗靶点具有高亲和力的真菌分子。这种天然杂交解决了临床转化中的关键挑战——生物冠层的不可控形成，因为生物合成过程赋予AuNPs预组装的生物活性有机冠层，避免了非特异性蛋白质和脂质吸附对纳米材料药代动力学的干扰。
