晚期颈动脉粥样硬化相关组织特异性中度DNA甲基化改变：microRNA调控区低甲基化特征

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Tissue-specific moderate DNA methylation alterations featuring hypomethylation in microRNA regulatory regions associated with advanced carotid atherosclerosis

DNA甲基化（DNA methylation）是参与基因表达调控的重要表观遗传机制，但其在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）中对microRNA（miRNA）基因调控的贡献仍知之甚少。方法：研究人员使用靶向亚硫酸氢盐测序（targeted bisulfite sequencing）分析了92例晚期颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis）患者血管组织及配对外周血白细胞中五个microRNA基因（MIR10B、MIR21、MIR100、MIR127和MIR143）调控元件及基因体的DNA甲基化，并分析了32例亚临床动脉粥样硬化对照的外周血白细胞。结果：研究人员发现了所有研究microRNA基因区域的组织特异性DNA甲基化模式。与完整血管组织相比，颈动脉粥样硬化斑块中MIR10B、MIR127和MIR100的调控区呈中度低甲基化。研究人员进一步将结果与实验室内部及公开全表观基因组甲基化数据集整合，并使用计算去卷积评估血管和血细胞组成的贡献。在调整估计的血管细胞比例后，MIR100和MIR127区域内CpG位点甲基化仍与动脉粥样硬化相关。位于MIR100 E-box区域的一个CpG位点（chr11:122025143，GRCh37/hg19）DNA甲基化升高与代谢综合征相关，而动脉粥样硬化斑块中MIR10B、MIR21和MIR127的DNA甲基化水平与组织学不稳定性指标和急性脑血管事件史相关。在外周血细胞中，研究人员观察到患者相比对照主要于MIR10B、MIR21调控区和MIR100 E-box区域内单个CpG位点的中度低甲基化。然而，MIR10B甲基化与估计血细胞组成仅呈弱相关。在血液中，MIR10B和MIR143甲基化与脂质代谢和颈动脉狭窄相关，而MIR21 CpG岛显示血液和斑块甲基化之间强对应。使用miRNA-seq分析血管样本中microRNA表达，研究人员鉴定出miR-143–3p、miR-21–5p、miR-100–5p、miR-145–5p、miR-145–3p和miR-10b-5p为表达最高的microRNA。MIR10B和MIR143HG（CARMN）启动子内CpG位点甲基化与相应microRNA表达呈负相关。讨论：晚期颈动脉粥样硬化的特征是microRNA基因特定的中度组织相关DNA甲基化模式，主要涉及调控区低甲基化。这些表观遗传转变由血管细胞组成变化和血管壁功能状态共同驱动，能够高度协调地调节microRNA表达谱。这些发现突出了有前景的候选位点和生物标志物，用于预测动脉粥样硬化的复杂病程，值得在更大的独立队列中进一步验证。

研究背景：动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种以慢性炎症、脂质蓄积和血管壁重塑为特征的复杂动脉病变。晚期斑块破裂或侵蚀可触发血小板黏附、血栓形成、动脉闭塞及急性缺血事件，包括冠状动脉疾病、心肌梗死和缺血性卒中。microRNA（miRNA）是长约16–27个核苷酸的单链非编码RNA，在转录后水平调控基因表达；约2,500个人类miRNA中近150个在心血管系统发挥关键作用。miRNA可双向调控AS起始、进展和终末事件。既往在人类颈动脉斑块中报道了miR-21、miR-143/-145、miR-100和miR-127等表达改变，但结果仅部分重叠。DNA甲基化是调控miRNA基因的重要表观遗传机制，然而相关研究多集中于肿瘤；全表观基因组关联研究（epigenome-wide association studies，EWAS）多分析外周血中基因间区或蛋白编码基因CpG位点，血管组织或斑块研究较少。既往研究曾报道MIR10B、MIR127低甲基化和MIR143/MIR145簇高甲基化，但尚无研究全面考察颈动脉粥样硬化斑块中miRNA基因调控元件DNA甲基化。因此，研究人员在晚期颈动脉粥样硬化患者中同时分析血管组织和外周血白细胞，以识别疾病相关甲基化模式，并为斑块不稳定性和AS相关并发症的甲基化标志物提供依据。研究显示晚期颈动脉粥样硬化以组织特异性中度DNA甲基化改变为特征，主要涉及miRNA调控区低甲基化；调整血管细胞异质性后，MIR100和MIR127甲基化仍与颈动脉粥样硬化独立相关；MIR100与代谢综合征相关，MIR10B、MIR21、MIR127与斑块组织学不稳定和急性脑血管事件（acute cerebrovascular events，ACVE）史相关；血液中MIR10B、MIR143与脂代谢和颈动脉狭窄相关，MIR21 CpG岛血-斑块一致，提示其作为替代生物标志物的潜力。意义在于提供候选位点和生物标志物，但仍需更大独立队列验证。

关键技术方法概括：样本队列来源为托姆斯克国家研究医学中心医学遗传研究所，纳入92例晚期颈动脉粥样硬化患者（70%男性，中位年龄64岁；狭窄大于65%，行颈动脉内膜切除术）和32例亚临床动脉粥样硬化对照（60%男性，中位年龄67岁）。采集患者术前外周血、颈动脉粥样硬化斑块、邻近大体完整颈动脉组织、大隐静脉及对照外周血。主要方法为靶向亚硫酸氢盐扩增子测序（bisulfite amplicon sequencing，BSAS）于MiSeq平台；内部EWAS采用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip；miRNA-seq于HiSeq 1,500；整合GEO数据集GSE46394、GSE66500、GSE149759、GSE69138、GSE246337；采用HEpiDISH/EpiDISH和WGCNA进行细胞组成估计与关联分析；统计在R中完成。

研究结果：
3.1 血液与血管组织间MIR10B、MIR21、MIR100、MIR127和MIR143基因区域DNA甲基化水平的组织特异性。研究人员通过靶向BSAS分析8个区域，发现所有区域中位甲基化呈组织特异性：患者与对照白细胞间高度相似，但血液与血管组织不同；MIR21三个区域、MIR100 E-box和MIR143HG启动子在白细胞中较高，MIR143基因体和MIR10B在血管组织中较高；MIR127区域总体高甲基化，chr14:101349764与单核苷酸变异rs34163305:C>T相关。结论：所分析microRNA基因区域存在明显组织特异性DNA甲基化模式。
3.2 颈动脉粥样硬化患者血管组织中microRNA基因甲基化。
3.2.1 MIR10B和MIR127 CpG岛、MIR21和MIR143基因体及MIR100调控区在颈动脉粥样硬化病变中呈中度低甲基化。与完整颈动脉组织相比，斑块中MIR10B区域、MIR21基因体、MIR100 E-box和MIR143基因体中位甲基化降低，斑块也低于大隐静脉，MIR127区域呈相似趋势；MIR143HG启动子cg01558401在斑块中较高。BSAS与内部EWAS及GEO数据总体一致。结论：颈动脉斑块中多个microRNA基因/调控区中度低甲基化，而MIR143HG启动子呈高甲基化。
3.2.2 调整估计血管细胞组成后MIR100和MIR127基因甲基化仍与颈动脉粥样硬化相关。通过计算去卷积估计血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）、平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs）和免疫细胞（immune cells，ICs）比例，MIR10B、MIR127大多和MIR143基因体甲基化与SMC正相关，MIR21和MIR143HG启动子与IC正相关；cg01558401与IC、cg21242144与SMC强相关且彼此负相关。回归调整后，MIR100 E-box两个CpG和MIR127两个CpG仍与颈动脉状态相关。结论：这些位点关联不完全由细胞组成解释。
3.2.3 颈动脉粥样硬化斑块中MIR10B、MIR21和MIR127基因DNA甲基化水平与组织学斑块不稳定指标和急性脑血管事件相关。结合组织学，MIR21推定启动子部分CpG及区域中位在斑块肩部出血、泡沫细胞中降低；MIR21基因体cg02515217及中位在纤维帽破裂或钙化中升高；MIR10B cg14399060在斑块表面血栓中降低。MIR127多个CpG与帽厚度、坏死核大小和炎症细胞数相关；ACVE史患者MIR127七个CpG差异，两个相邻CpG升高且与不稳定指标负相关。结论：MIR10B、MIR21、MIR127甲基化与斑块不稳定性和ACVE史相关。
3.2.4 动脉粥样硬化斑块中MIR100 E-box区域单个CpG位点DNA甲基化升高与代谢综合征相关。BSAS显示chr11:122025143在代谢综合征患者中甲基化更高，其他临床特征无显著关联。结论：MIR100 E-box该位点高甲基化与代谢综合征相关。
3.2.5 MIR10B和MIR143HG（CARMN）甲基化与相应microRNA表达相关。miRNA-seq显示斑块中高表达miR-143–3p、miR-21–5p、miR-100–5p，以及miR-145–5p、miR-145–3p、miR-10b-5p；复发再狭窄样本多数miRNA协调下调。7个CpG与4个miRNA表达呈8个显著负相关：MIR10B启动子cg27160395与miR-10b-3p/5p负相关；MIR143HG转录起始位点附近位点与miR-143–3p/miR-145–3p负相关，而基因体位点正相关。结论：MIR10B启动子和MIR143HG（CARMN）甲基化与相应miRNA表达相关。
3.3 动脉粥样硬化中外周血白细胞中microRNA基因甲基化。
3.3.1 颈动脉粥样硬化患者血白细胞中MIR10B、MIR21推定启动子、MIR21 CpG岛和MIR100 E-box低甲基化。患者与对照比较，MIR10B、MIR21 CpG岛和MIR100 E-box个别CpG低甲基化，区域中位仅MIR21推定启动子显著低；与外部卒中EWAS总体可比，ACVE史影响小。结论：晚期颈动脉粥样硬化患者血白细胞存在中度低甲基化。
3.3.2 动脉粥样硬化患者血白细胞中MIR10B和MIR143基因DNA甲基化水平与血脂和颈动脉狭窄程度相关。血MIR10B chr2:177015208与血糖、总胆固醇和动脉粥样硬化指数强负相关，cg12215739与动脉粥样硬化指数强负相关，二者与低密度脂蛋白（low-density lipoproteins，LDL）和狭窄中度负相关；MIR143HG启动子位点与狭窄和甘油三酯（triglycerides，TG）强负相关，MIR143基因体位点与狭窄、总胆固醇、LDL正相关且与年龄中度负相关；亚临床对照未复制。结论：血MIR10B和MIR143甲基化与脂代谢和颈动脉狭窄相关。
3.3.3 MIR21基因体和MIR143基因体甲基化水平与血液细胞组成相关。在GSE246337中用EpiDISH估计七种免疫细胞，MIR143基因体cg16684117和cg21242144与B细胞、CD4⁺ T细胞比例强正相关，cg01558401与中性粒细胞及斑块IC浸润相关。结论：血液细胞组成是部分miRNA相关CpG甲基化变异来源。
3.3.4 外周血中MIR21 CpG岛甲基化反映颈动脉粥样硬化斑块中的甲基化状态。斑块与外周血白细胞比较，MIR10B区域、MIR21推定启动子、MIR21 CpG岛和MIR143基因体中位甲基化正相关；最强为MIR10B cg14399060，MIR21 CpG岛四个连续CpG相关系数大于0.7。结论：外周血白细胞可能作为颈动脉斑块甲基化的替代材料，MIR21 CpG岛最合适。

讨论部分总结：研究优势在于同一患者配对分析斑块、邻近完整颈动脉和外周血白细胞，覆盖miRNA基因体及调控元件，结合配对miRNA表达和公共EWAS。结果提示晚期颈动脉AS以血管壁中度低甲基化为主，MIR100和MIR127在调整估计细胞组成后仍相关；MIR10B/MIR127及MIR143基因体甲基化与SMC相关，MIR21/MIR143HG启动子与IC相关；血液中MIR21、MIR127和MIR143受免疫细胞组成影响，MIR10B较稳健。MIR127呈高构成性甲基化；MIR100 E-box与代谢综合征；MIR10B低甲基化与既往观察一致，启动子甲基化与miR-10b表达负相关。MIR143HG（CARMN）呈转录起始位点附近负相关、基因体正相关的位点特异性双模式。小效应1%–5%在复杂非恶性慢性病外周血中常见，可能具功能。血-斑块一致支持外周血替代。局限包括样本量、区域有限、横断面设计、对照有亚临床AS、细胞比例计算估计、配对有限、缺乏功能验证。

研究结论翻译：本研究显示，晚期颈动脉粥样硬化相关组织特异性中度DNA甲基化改变以microRNA调控区低甲基化为特征。所分析microRNA基因区域的DNA甲基化谱在血管组织和血液中均深受细胞组成影响。调整血管细胞异质性后，MIR100和MIR127基因内甲基化改变仍与颈动脉粥样硬化独立相关。MIR10B内DNA甲基化与血细胞组成仅呈弱相关。在颈动脉粥样硬化斑块中，MIR100内甲基化改变与代谢综合征相关，而MIR10B、MIR21和MIR127改变与组织学斑块不稳定性和急性脑血管事件史相关。在血液中，MIR10B和MIR143甲基化与脂质代谢和颈动脉狭窄相关，而MIR21 CpG岛甲基化显示血液与斑块之间强对应，支持其作为未来研究中替代生物标志物的潜力。研究人员的结果提供证据表明，MIR10B启动子和MIR143HG（CARMN）DNA甲基化与其相应microRNA表达相关，这些microRNA在血管组织中呈优势高表达谱。病理血管组织中观察到的收缩性平滑肌细胞簇（miR-143/145）下调可由表观遗传开关机制解释，其特征为启动子高甲基化引起的经典沉默，并伴随内含子/外显子基因体的替代调控。