跨物种单细胞与空间转录组学解析炎症性关节炎保守基质重塑景观：血管周围Notch/AP-1–Fn1/THBS调控轴

《Frontiers in Molecular Medicine》：Cross-species single-cell and spatial transcriptomics map the conserved stromal remodeling landscape of inflammatory arthritis

背景：类风湿关节炎（RA）是一种以慢性滑膜炎症和关节破坏为特征的疾病。然而，连接细胞活化与基质介导病理的精确网络仍定义不足，阻碍靶向治疗开发。

方法：研究人员整合了多个临床前小鼠模型中的单细胞RNA测序（scRNA-seq），构建统一的滑膜炎症性关节炎景观，随后利用Visium HD空间转录组学在人类RA数据集中验证发现。

结果：小鼠滑膜的无监督聚类解析出不同的结构、血管和免疫生态位。互作组映射鉴定出血管壁细胞（Vascular Mural cells）为接收内皮来源和壁来源Notch信号的中心枢纽。在此血管周触发因素下游，调控网络分析揭示一个同步、应激诱导的Atf3/Fos（AP-1）转录因子调节子程序，协调肌成纤维细胞分化。该通路在人类RA中保守；一个同源基质重塑基因表达模块（SM01，包括VIM、FN1、MMP2）在人类活化滑膜成纤维细胞（Activated FLS）和衬里滑膜成纤维细胞（Lining FLS）中高度活跃。Visium HD空间映射在物理上定位这些回路，证明FN1和THBS信号网络共定位于一个限制在滑膜组织边缘的高度活跃生态位中。

结论：研究人员定义了一个保守的Notch/AP-1至Fn1/THBS模块调控轴，其在一个独特空间生态位中运作。该模型超越传统细胞图谱，识别出可能有助于同时阻止滑膜炎症和关节破坏的治疗靶点。

研究背景与问题：类风湿关节炎（RA）是一种慢性、系统性自身免疫病，以持续性滑膜炎症、软骨降解和进行性关节破坏为特征。尽管靶向TNF-α、IL-6和JAK/STAT等经典免疫介质的生物制剂和小分子疗法已临床实施，但相当一部分患者仍出现难治性疾病或不完全缓解。这一临床缺口反映当前治疗范式的基本局限：已批准疗法多抑制系统性免疫活化，却常不能阻止局部、自放大的基质重塑过程。滑膜基质主要由成纤维细胞样滑膜细胞（FLS；fibroblast-like synoviocytes）、内皮细胞和血管周壁细胞组成，已从白细胞浸润的被动旁观者转变为RA的活跃病理驱动者。滑膜成纤维细胞可转变为侵袭性肌成纤维细胞表型，异常表达基质金属蛋白酶（MMPs；matrix metalloproteinases）、沉积异常细胞外基质（ECM；extracellular matrix），并通过持续趋化因子梯度招募免疫细胞。然而，启动该基质转变的微环境触发因素、锁定致病状态的下游转录网络以及维持自放大信号生态位的空间结构仍不清楚。因此，研究人员开展跨物种单细胞与空间转录组研究，以构建炎症性关节炎滑膜重塑的保守景观。

研究开展、结论与意义：研究人员整合多个临床前小鼠模型的单细胞RNA测序（scRNA-seq；在单细胞水平检测转录组）数据，构建统一的滑膜炎症性关节炎细胞景观，并利用Visium HD空间转录组学在人类RA数据集中验证。研究识别出高度活跃、保守的血管至结构信号轴，涉及Notch信号作为基质激活的主要物理触发因素；并定义保守的Notch/AP-1至Fn1/THBS模块调控轴，该轴在滑膜组织边缘的独特空间生态位中运作。该模型超越传统细胞图谱，识别出可能同时阻止滑膜炎症和关节破坏的治疗靶点，提示以基质和血管为导向的治疗范式。

关键技术方法：研究人员整合公开小鼠炎症性关节炎scRNA-seq数据集，包括12例健康对照和15例RA样本，来源包括GSE206651、GSE185696、GSE224221（CIA）、GSE145286（STIA）、GSE193536（AIA）、GSE184609（G6PI）、GSE230145及GSE129087（CD45^- STIA）。主要方法包括Trailmaker和ICARUS v3进行质控、scDblFinder去除双细胞、Harmony整合、Leiden聚类与UMAP可视化；CellChat推断细胞通讯、SCENIC重建调控网络、Metascape/STRING-DB/TRRUST富集分析、DESeq2进行伪bulk差异表达。人类空间转录组使用未治疗RA滑膜Visium HD公开数据集（Zenodo DOI: 10.5281/zenodo.16995699），经VST-DAVis v1.0、Space Ranger质控、PCA、Louvain聚类和CellChat空间通讯分析。

研究结果：

3.1 炎症性滑膜微环境的单细胞图谱鉴定出不同生态位：通过整合多模型小鼠滑膜scRNA-seq，经质控和批次校正后，无监督聚类和UMAP将滑膜微环境解析为三个主要功能生态位：结构/纤维增殖生态位、血管/内皮生态位和免疫（髓系/淋巴）生态位。结构生态位包括衬里FLS、炎症衬里FLS、通用亚衬里祖细胞（Sublin_Pi16⁺）、特化亚衬里基质细胞（Sublin_Calb1⁺）、机械敏感亚衬里FLS（Sublin_Dkk3⁺）、纤维生成亚衬里FLS（Sublin_Postn⁺）、活化FLS（AcFLS）、肌成纤维细胞、炎症祖细胞、软骨细胞和成骨细胞。血管/内皮生态位包括血管壁细胞（Vasc_Mural）、血管周成纤维细胞、淋巴内皮细胞、活化内皮细胞和静脉内皮细胞。髓系免疫生态位包括常驻衬里巨噬细胞、亚衬里滑膜巨噬细胞、炎症巨噬细胞、抗原呈递巨噬细胞/树突细胞、炎症单核细胞、破骨细胞、活化中性粒细胞和静息/募集中性粒细胞。淋巴/肥大生态位包括T/NK细胞、B细胞、浆细胞/增殖性B细胞、肥大细胞，外周胶质生态位包括Schwann细胞。

3.2 炎症性关节炎中的转录动态与功能富集：通过比较炎症关节与健康对照关节的差异表达，采用|Log2 FC|>0.5和padj<0.05阈值。火山图分析显示RA关节中转录程序显著上调。上调差异表达基因（DEGs）的通路富集突出先天免疫级联（中性粒细胞脱颗粒、血小板活化和聚集）以及ECM信号（ECM组织、超分子纤维组织），还包括黏着斑、蛋白水解调节、IL-17A信号和TNF产生正调节。蛋白-蛋白互作和MCODE网络分析进一步鉴定出胶原形成、ECM组织、对外部刺激反应、肌动蛋白丝组织和rRNA代谢过程等功能模块。相反，下调DEGs富集于伤口反应、发育生长、血管发育、胶质细胞命运特化、生物矿化组织和脂肪酸代谢过程。结果表明炎症关节发生协调转录转变，从基础代谢和结构组织稳态转向免疫细胞活化、持续炎症因子信号和病理性基质重塑。

3.3 CellChat互作组映射鉴定血管壁细胞和亚衬里成纤维细胞为滑膜网络枢纽：通过CellChat分析小鼠scRNA-seq数据的细胞通讯。RA关节中结构和壁 compartments 通讯选择性激增，部分巨噬细胞和单核细胞群体是这些活化亚群传入通讯的显著靶标。亚衬里祖细胞（Sublin_Pi16⁺ Cd34⁺）、纤维生成亚衬里FLS（Sublin_Postn⁺）、血管壁细胞和衬里FLS（Lin_Prg4 Cd74⁺和Prg4 Il6⁺）成为关节炎关节中强上调的信号枢纽。Notch配体-受体相互作用分析显示，Jag1和Dll4配体占主导。血管壁细胞内自分泌Jag1-Notch3信号和内皮至壁细胞Dll4-Notch3通讯（Act_EC→Vasc_Mural）是疾病状态最高强度信号连接。血管壁细胞Jag1-Notch2与炎症单核细胞和亚衬里巨噬细胞通讯；内皮细胞通过Dll4-Notch2向炎症单核细胞、亚衬里巨噬细胞和中性粒细胞传递炎症信号，并通过Dll4-Notch1靶向炎症单核细胞。SCENIC调控网络分析显示，在血管壁细胞、软骨细胞、炎症祖细胞、特化亚衬里亚群和部分巨噬细胞亚群中，Atf3和Fos调节子与Egr1和Klf调节子同步活跃，提示协调基质重塑和巨噬细胞活化的同步调控状态；伪bulk DESeq2验证了簇特异性一致性。

3.4 向人类RA的转化鉴定炎症基质中保守基质重塑和Notch程序的高活性：研究人员分析人类RA空间单细胞Visium HD数据集，映射人类滑膜主要细胞谱系。热图分析确认人类滑膜生态位中保守的细胞类型特异性标记。血管壁谱系分为两个亚簇：血管壁细胞富集NOTCH3、ACTA2、TAGLN以及基底膜/胶原基因如COL4A1；血管周/外膜基质细胞高表达平滑肌收缩和血管周结构标记MYH11、MCAM、PLN、TBX2和IGFBP3。FLS谱系显示功能分区：活化FLS富集关节破坏性蛋白酶、炎症介质和组织重塑驱动因子，包括MMP1、MMP3、S100A8、TWISTNB和CEMIP；经典衬里FLS和炎症衬里FLS共表达PRG4、CRTAC1、PCSK6和THBS4；致病亚衬里基质群体表达ECM沉积标记COL1A1、ASPN、COMP、THBS2和FNDC1。WGCNA共表达分析返回1个模块SM01，核心基因包括VIM、CTSB、FN1、FTL、PLA2G2A、CD74、MMP2、COL6A2、SELENOP和COL3A1。SM01模块活性在人类活化FLS中选择性富集，并在衬里FLS（Lin_Prg4和炎症Lin_Prg4）中显著表达。这些人类群体代表小鼠亚衬里成纤维细胞、血管壁和衬里FLS枢纽的功能和转录同源物，提示Atf3/Fos应激反应通路及其下游基质重塑程序可能是人类RA炎症基质表型的保守驱动因素。

3.5 高分辨率空间转录组学映射人类RA结构-血管炎症生态位：利用高分辨率hRA Visium HD空间转录组数据集，研究人员直接映射这些通讯网络的物理结构。空间传入和传出信号模式分析鉴定活化FLS为组织中的中央空间协调者，是Collagen、FN1、Tenascin和THBS配体的主要来源，同时高度接受传入NOTCH、THBS和FN1信号。空间弦图解析组织内细胞类型特异性方向通讯回路，确认血管周成纤维细胞向血管壁细胞上的NOTCH3呈递JAG1信号；同时，由THBS2、THBS4和COMP介导的多细胞结构网络将衬里FLS和活化FLS连接至浆细胞和活化FLS上的受体SDC1和CD47。空间叠加图显示FN1和THBS信号网络在组织架构中高密度共定位，最高强度集中在组织边缘的活跃炎症生态位，该生态位富集活化FLS、衬里FLS和血管周壁细胞。这些空间转录组发现提示，应激诱导、Notch驱动的信号和基质重塑网络组织为局部结构-血管生态位，协调人类RA慢性滑膜炎症。

讨论与结论：本研究呈现跨物种、空间分辨的单细胞转录组分析，旨在解码炎症性关节炎尤其RA的细胞景观和信号网络。通过整合小鼠炎症性关节炎模型与人类单细胞及高分辨率空间转录组学，研究人员识别特化基质亚群、成骨细胞、软骨细胞和内皮细胞，并发现血管壁和血管周成纤维细胞是突出的通讯枢纽。互作组分析显示血管/血管周和基质亚群为关键上调通讯枢纽，并与常驻和募集的滑膜巨噬细胞持续串扰。研究鉴定出高强度血管周Notch信号轴，由血管壁细胞中自分泌Jag1-Notch3和内皮至壁细胞Dll4-Notch3信号锚定；活化的内皮和血管壁细胞通过Dll4-Notch2和Jag1-Notch2向浸润髓系群体传递炎症信号。下游单细胞调控网络发现由Atf3和Fos调节子同步活性定义的细胞类型特异性调节子簇，与Egr1及Krüppel样因子Klf4和Klf10共聚，提示其作为统一调控枢纽驱动肌成/成纤维细胞分化。关节炎关节差异表达显示双重失衡：上调程序富集关节破坏过程，下调程序富集稳态和再生通路。人类Visium RA数据中，SM01模块包含核心基质重塑基因，在人类活化FLS和衬里FLS中高富集，提示小鼠模型在许多方面代表人类基质介导的关节病理。高分辨率空间转录组验证部分细胞网络：人类活化FLS是COLLAGEN、FN1、TENASCIN和THBS通路的中央空间发送者，同时接受NOTCH、THBS和FN1信号；空间弦图确认血管周JAG1-NOTCH3信号以及靶向浆细胞和活化FLS上SDC1和CD47的多细胞THBS/COMP网络；FN1和THBS网络共定位于组织边缘活跃炎症生态位。局限性包括：空间转录组数据来自单个未经治疗RA供体，作为概念验证，未来需更广泛验证；CellChat推断潜在微环境信号而非确认体内直接物理细胞接触，未来需要功能实验验证。综合而言，血管来源Jag1和Dll4激活邻近基质和免疫细胞上的Notch3/2，启动Atf3/Fos转录级联，驱动髓系活化和组织边缘局部自放大空间生态位中的基质重塑程序。该模型提示以基质和血管为导向的治疗范式：选择性阻断Notch3/2活化或内皮配体呈递可特异性解耦血管至基质和血管至免疫串扰，防止致病FLS活化和免疫浸润；联合血管周Notch通路抑制与下游基质重塑网络（THBS或FN1）或AP-1转录因子（Atf3/Fos）靶向治疗，可能协同阻止慢性炎症和结构性关节破坏。

研究结论翻译：本研究致力于开发跨物种、空间分辨框架，以解码驱动RA的细胞动力学。通过整合小鼠单细胞与人类空间转录组学，研究人员将关节微环境解析为功能性生态位。研究模型提示一个保守血管信号轴，其中血管周来源Jag1和Dll4触发邻近壁细胞、亚衬里成纤维细胞和滑膜巨噬细胞亚群上的Notch3/2，并可检测到同步Atf3/Fos转录程序。该调控级联直接协调人类同源基质重塑模块在滑膜组织边缘非常活跃空间生态位中的表达，该生态位高度富集AcFLS、Lining FLS和Perivascular Mural cells。靶向这些上游血管周机制及其与强下游基质重塑模块的联系，可能提供多层级治疗策略，以预防RA慢性炎症和结构性组织损伤。