多水解酶敲除相同、结局迥异：CRISPR/Cas9编辑工作流程塑造CHO细胞表型与转录组

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Same hydrolase knockouts, different outcomes: CRISPR/Cas9 editing workflow shapes resulting cellular phenotype and transcriptome in CHO

摘要专业翻译 基于CRISPR/Cas9的多基因敲除（knockout, KO）策略被广泛用于工程化中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞，然而编辑工作流程对细胞结局的影响仍知之甚少。本研究系统比较了顺序编辑（sequential editing）与多重编辑（multiplex editing）两种策略，以生成缺失九种聚山梨酯（polysorbate, PS）降解水解酶的CHO细胞系。两种策略均实现了相当的功能结局，显著改善了PS稳定性。然而，二者产生了截然不同的表型与转录组轨迹。顺序编辑导致生长与活力进行性下降、细胞尺寸与DNA含量增加，以及广泛的转录组重塑。相比之下，多重编辑引起较温和的表型改变和显著更小的转录足迹，但克隆间异质性增加。转录组分析显示最终状态之间重叠有限，表明尽管目标敲除集合相同，仍存在工作流程特异的适应性变化。重要的是，转录变化主要与克隆筛选和反复操作相关，而非反映针对目标敲除本身的共同响应。这些发现表明，基因组编辑工作流程可以独立于预期遗传修饰而塑造细胞表型。就细胞系开发而言，当靶向非必需基因时，多重编辑提供了一种缩短开发时间并限制不利漂移的策略，凸显了将工程策略视为关键设计参数的必要性。

论文解读

一、研究背景与科学问题

中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞是重组治疗性蛋白生产的主导哺乳动物宿主，占已批准单克隆抗体和众多生物药的大多数，得益于其良好的安全性、悬浮培养中的稳健生长以及人源兼容的翻译后修饰能力。过去四十年来，细胞系工程已成为进一步优化CHO生产平台的关键策略，其中靶向基因敲除（knockout, KO）在改善产品质量、消除有害宿主细胞蛋白（host cell proteins, HCPs）以及提升细胞生产力方面尤为有效。早期工程努力依赖随机诱变或RNA干扰，而可编程基因组编辑技术的引入实现了精确高效的基因破坏，加速了KO策略在工业细胞系开发中的应用。近年来，CRISPR/Cas9使得在单个CHO细胞系中同时或顺序破坏多个基因成为可能，多基因KO策略在表型依赖冗余基因家族、需同时去除多种问题HCP或补偿机制可能限制单基因编辑效果时尤为具有吸引力。

多基因编辑也引入了新挑战。顺序编辑工作流程需要多轮转染、单细胞克隆和长期培养，而多重编辑同时引入多个基因组扰动，可能需要重复转染以实现充分编辑。加之CHO细胞固有的基因组可塑性，这些步骤可能施加选择压力并产生生长、代谢或生产力改变的克隆。基因组编辑本身也可引入非预期基因组改变，包括脱靶突变或双链断裂后的大规模结构重排。因此，系统评估编辑工作流程对于区分预期KO效应与编辑过程本身效应至关重要。

本研究旨在系统比较顺序编辑与多重编辑两种策略在生成缺失多种PS降解水解酶的CHO细胞系时的差异。由于多重编辑可缩短开发时间并减少重复克隆筛选，研究人员询问其是否在实现相同功能终点的同时，相对顺序编辑影响表型和转录组漂移。通过分析两种工作流程的中间和最终KO克隆，利用补料分批表型分析、靶向细胞检测和RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）考察KO相关效应与工作流程相关适应。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员使用勃林格殷格翰专有的CHO-K1谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS）^?/?悬浮适应细胞系。顺序编辑从敲除Lpl开始，依次引入Pla2g7、Pla2g15/Lipa、Ces簇2、Ces簇1及Iah1/Ppt1；多重编辑以相同Lpl敲除起始，逐步去除两个Ces簇后，在重复多重转染中同时靶向其余五个基因。主要技术方法包括：RNA测序（RNA-seq）用于转录组分析；荧光胶束检测（fluorescence micelle assay）用于功能验证PS稳定性；ambr15^?系统进行补料分批培养；流式细胞术通过Tali细胞周期试剂盒测定DNA含量和细胞周期；差异表达分析采用limma-voom框架，功能富集分析使用clusterProfiler；UMAP用于低维嵌入可视化。

三、研究结果

3.1 顺序与多重多KO细胞系的生成

顺序编辑需383天培养、七轮电穿孔和七轮单细胞克隆获得最终多KO克隆；多重编辑需250天、十一轮电穿孔但仅四轮单细胞克隆。多重编辑电穿孔次数更多源于低sgRNA效率需要额外转染。RNA-seq确认最终克隆中靶向基因转录本缺失或显著减少，ICE分析结合PCR和凝胶电泳确认所有预期位点编辑成功。荧光胶束检测显示PS保留率从亲本对照约30%–45%提升至最终S-KO和M-KO克隆的75%以上，两种策略均实现功能收敛。

3.2 顺序与多重编辑的表型影响

在顺序编辑谱系中，峰值活细胞密度（viable cell density, VCD）和收获活力随KO引入逐步下降，亲本峰值VCD为25×10⁶ cells/mL，最终S-KO克隆降至15–17×10⁶ cells/mL，收获活力从>90%降至50%–60%。多重编辑谱系中生长也随KO数增加逐步下降，但最终克隆保留更好生长特性，峰值VCD在17–21×10⁶ cells/mL之间，收获活力在55%–80%之间，但克隆间异质性增加。乳酸代谢方面，顺序谱系中S-LP和S-LPPLC中间克隆乳酸清除受损，多重谱系中去除Ces簇1后最终M-KO克隆乳酸水平持续升高。顺序编辑中Pla2g15和Lipa敲除后细胞直径增加且未逆转，并与DNA含量增加和增殖减少相关；多重编辑中仅M-KO4出现类似克隆特异性事件。葡萄糖消耗在两种工作流程中呈现不同模式，顺序编辑最终克隆消耗升高而多重编辑最终克隆消耗降低。

3.3 顺序与多重编辑的转录组范围后果

最终S-KO克隆相对亲本有425个上调基因和415个下调基因，而最终M-KO克隆仅162个上调基因和109个下调基因，直接比较显示894个基因在S-KO中更高、1003个基因更低。UMAP分析显示顺序谱系中间克隆逐步远离亲本状态，多重谱系占据更受限的转录空间，最终两种工作流程形成分离簇。阶段解析DE分析显示顺序编辑中Pla2g15/Lipa敲除步骤首次出现显著转录跃升（87上/83下），Ces簇1删除后出现更大跃升（346上/250下），且这些变化大多在最终克隆中持续；多重谱系转录变化始终较小。GO富集分析显示S-KO上调基因富集于细胞外空间、分泌因子相关注释，M-KO除细胞外富集外还显示转录调控和发育信号相关术语。

3.4 尽管PS稳定化收敛，转录适应仍出现分歧

最终S-KO和M-KO状态间重叠有限：上调基因仅50个共享（375个顺序特异、112个多重特异），下调基因仅15个共享（400个顺序特异、94个多重特异）。共享核心包含Cd109、Serpine1、Fn1、Angptl4、Csf1、F7等细胞外或细胞表面因子，以及Prrx1、Notch1、Smad6、Dtx4等调控基因。对候选PS降解丝氨酸水解酶面板的检查未发现广泛转录补偿证据，仅Pla1a和Abhd14b在S-KO中、Liph在M-KO中明显上调，Ppt2在两种最终状态中均下调。

四、讨论与结论

研究人员指出，顺序KO克隆表现出更大转录足迹和进行性生长特性恶化，多重KO克隆虽存在工作流程相关改变但整体转录偏离较小，这与CHO细胞固有基因组可塑性一致。顺序编辑需多轮电穿孔和单细胞克隆，施加选择压力驱动遗传漂移和转录分歧；阶段解析转录组分析表明主要转录转变与克隆筛选步骤相关而非单个编辑事件或培养时长。研究强调早期全面筛选和谨慎克隆选择的重要性，因为早期引入的不利性状可能在整个谱系中传播。关于补偿机制，转录组分析未发现普遍补偿响应，各工作流程特异性上调的候选水解酶反映谱系特异性适应而非一般补偿机制。顺序编辑适合靶向可能具有合成致死性或必需功能的基因，可在破坏额外基因前监测中间表型；多重编辑缩短开发时间、减少克隆筛选步骤并降低表型和基因型漂移，但高度依赖sgRNA效率和基因型优先筛选。最终克隆选择应结合基因型确认、补料分批性能评估和PS稳定性筛选。研究结论为：顺序和多重基因组编辑策略可引入相同水解酶KO基因型并实现相同PS稳定化表型，却产生不同表型和转录轨迹；对于非必需HCP靶点集合，多重编辑是优选开发策略，因其以更短开发时间和更少单细胞克隆轮次达到相同功能终点，同时限制了顺序谱系中累积的生长、DNA指数和转录组漂移。