松萝酸与唑类药物联用增强抗真菌疗效的系统评价

《Frontiers in Microbiology》：Enhanced antifungal efficacy of azole drugs through combination with usnic acid

摘要专业翻译 引言： 耐药性真菌感染仍是重大临床挑战，抗真菌佐剂为恢复唑类药物疗效提供了有前景的策略。本研究探讨了本身缺乏内在抗真菌活性的松萝酸（usnic acid, UA）能否增强伊曲康唑（itraconazole, ITR）、伏立康唑（voriconazole, VOR）、泊沙康唑（posaconazole, POS）、艾沙康唑（isavuconazole, ISA）和氟康唑（fluconazole, FLU）对临床相关真菌病原体的活性。 方法： 采用CLSI标准化肉汤微量稀释法和棋盘法，评估了UA与各唑类药物联用对曲霉属（Aspergillus spp.，n = 64）、念珠菌属（Candida spp.，n = 24）、皮炎外瓶霉（Exophiala dermatitidis，n = 14）和新隐球菌（Cryptococcus neoformans，n = 8）临床分离株的协同效应。根据临床用途，ISA仅针对霉菌进行测试，FLU仅针对念珠菌属和新隐球菌进行测试。相互作用按分数抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index, FICI）分类为协同（FICI ≤ 0.5）、无关（0.5 < FICI ≤ 4.0）或拮抗（FICI > 4.0）。各比率以95% Wilson置信区间报告，并采用Fisher–Freeman–Halton检验及Benjamini–Hochberg校正的配对Fisher精确检验进行比较。 结果： UA单独使用未显示抗真菌活性。各联用方案的总协同率分别为：UA+POS 67.27%（74/110；95% CI 58.05–75.33%）、UA+ITR 11.82%（13/110；95% CI 7.04–19.18%）、UA+FLU 9.09%（2/22；95% CI 2.53–27.81%）、UA+VOR 5.45%（6/110；95% CI 2.52–11.39%）、UA+ISA 0%（0/78；95% CI 0–4.62%）。经多重比较校正后，UA+POS的协同率显著高于其他各联用方案（P < 0.001）。UA+ITR未引起拮抗，而UA+POS仅在0.91%（1/110）的分离株中引起拮抗。UA+VOR和UA+FLU对新隐球菌表现出显著拮抗（分别为100%，8/8和87.5%，7/8）。UA+POS对土曲霉（A. terreus）和皮炎外瓶霉产生广泛协同作用，且与药物敏感性状态无关，而对烟曲霉（A. fumigatus）的活性主要局限于敏感分离株。机制实验显示，7株协同菌株中有5株活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高，4株外排泵受抑制，其中菌株382和PY1b同时表现出两种机制。 讨论： 上述发现确定UA+POS是最具前景的佐剂联用方案，而其种属及耐药状态依赖性效应提示该方案的活性需要结合具体情境审慎解读。ROS积累与外排泵抑制的双重参与支持其协同作用具有机制多样性。然而，这些结果仅限于体外实验，需进一步的机制研究和体内研究来评估UA+POS的治疗潜力与安全性。

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一、研究背景与问题

侵袭性真菌感染（invasive fungal infections, IFIs）是免疫受损患者发病和死亡的重要全球性健康威胁，高危人群包括中性粒细胞减少症患者、移植受者和危重症患者。曲霉属和念珠菌属仍是最主要病原体，但新隐球菌和暗色真菌（如皮炎外瓶霉）等病原体同样值得高度重视，这些真菌常呈多重耐药，极大限制了可用治疗手段。唑类药物（包括伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾沙康唑和氟康唑）通过抑制羊毛甾醇14α-脱甲基酶（CYP51）——真菌膜麦角甾醇合成的关键酶——发挥作用，但唑类药物的广泛和过度使用已导致耐药菌株的出现和传播，耐药机制包括CYP51突变、药物外排泵过表达和生物膜形成，常导致临床治疗失败。

与开发新型抗菌药物周期长、成本高相比，使用抗菌佐剂是一种更高效及时的策略，可降低主药剂量、减轻毒性、延缓耐药进化并延长既有药物的临床使用寿命。天然产物因化学结构多样、生物活性丰富，是发现新型抗菌佐剂的重要来源。松萝酸（usnic acid, UA）是从地衣（如松萝属）中提取的独特二苯并呋喃衍生物，传统医学中用于抗菌和抗炎。现代药理学研究证实其对多种革兰氏阳性菌、分枝杆菌和部分真菌具有活性，潜在机制包括膜破坏、能量代谢抑制和氧化应激诱导。尤其值得关注的是，初步研究提示松萝酸可有效抑制细菌外排泵，并可通过抑制外排泵或增强膜通透性恢复细菌对抗生素的敏感性。然而，松萝酸作为广谱唑类佐剂在抗真菌领域的潜力此前尚未被系统研究和评估。

二、研究内容与主要结论

本研究旨在系统评估松萝酸作为唑类药物广谱佐剂的潜力，通过体外药敏试验考察其与五种关键唑类药物（ITR、VOR、POS、ISA和FLU）联用对包括曲霉属、念珠菌属、皮炎外瓶霉和新隐球菌在内的大量临床分离株的协同效应，并初步探讨其潜在机制。研究填补了关键知识空白，为应对日益严峻的唑类耐药问题提供了新型联合治疗策略的候选方案。

三、关键技术方法

研究人员采用CLSI标准化的肉汤微量稀释法和棋盘微量稀释法进行体外药敏试验，以分数抑菌浓度指数（FICI）判定药物相互作用类型（协同FICI ≤ 0.5、无关0.5 < FICI ≤ 4.0、拮抗FICI > 4.0）。临床分离株均来源于湖北省荆州市中心医院和湖北省病原真菌感染临床医学中心，菌种经形态学鉴定和ITS rDNA测序确认。机制研究方面，采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针结合流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）水平，并采用罗丹明6G（R6G）外排实验评估外排泵功能。统计分析使用GraphPad Prism 8.0，交互作用率以95% Wilson置信区间报告，组间比较采用Fisher–Freeman–Halton精确检验和Benjamini–Hochberg校正的配对Fisher精确检验。

四、研究结果

1. UA与唑类药物对曲霉属的相互作用

对66株临床曲霉分离株的体外药敏试验显示，UA单独使用无明显抗真菌活性。UA与ITR和POS联用的协同率分别为9.38%（6/64）和70.31%（45/64），而UA与VOR或ISA联用未观察到协同，反而出现一定程度的拮抗（拮抗率分别为9.38%和6.25%）。UA+ITR的协同作用见于烟曲霉（14.29%，4/28）和黄曲霉（13.33%，2/15），而UA+POS对烟曲霉、黄曲霉和土曲霉的协同率分别达82.14%（23/28）、66.67%（10/15）和92.31%（12/13）。发生协同作用时，ITR和POS的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）分别降至0.125~0.5 μg/mL和0.03~0.5 μg/mL，显著降低了唑类药物的有效浓度。

2. UA与唑类药物对念珠菌属的相互作用

UA单独对多数念珠菌分离株（23/24，95.8%）活性有限（MIC ≥ 32 μg/mL）。联用时UA与所有测试唑类药物均表现出协同效应：UA/ITR协同率16.67%（4/24），UA/VOR为25%（6/24），UA/POS为66.67%（16/24），UA/FLU为14.28%（2/14）。UA/POS对白念珠菌、光滑念珠菌和耳念珠菌的协同率分别达83.33%（5/6）、60%（3/5）和80%（8/10），且对任何测试念珠菌均未观察到拮抗。UA/VOR对热带念珠菌（66.67%，2/3）和耳念珠菌（10%，1/10）表现出拮抗。

3. UA与唑类药物对皮炎外瓶霉的相互作用

UA单独对皮炎外瓶霉无抗真菌活性。UA/ITR和UA/POS的协同率分别为21.43%（3/14）和92.86%（13/14），UA与VOR或ISA联用未观察到协同效应。UA可将ITR和POS的MIC分别降至0.13~0.25 μg/mL和0.03~0.13 μg/mL。

4. UA与唑类药物对新隐球菌的相互作用

UA单独对新隐球菌无抑制活性。UA与任何测试唑类药物联用均未观察到协同效应，反而检测到显著拮抗：UA/VOR和UA/FLU的拮抗率分别高达100%（8/8）和87.5%（7/8）。

5. UA与唑类药物对病原真菌的相互作用总结

综合全部临床分离株数据，UA/ITR、UA/VOR、UA/POS、UA/ISA和UA/FLU的总协同率分别为11.82%（13/110）、5.45%（6/110）、67.27%（74/110）、0%（0/78）和9.09%（2/22）。五种联用方案的协同率差异显著（Fisher–Freeman–Halton精确检验，p < 0.001），经Benjamini–Hochberg校正后UA/POS的协同率显著高于其他每种联用方案。拮抗率在各联用方案间也存在显著差异（p < 0.001）。种属分组精确检验显示UA/POS协同率、UA/VOR协同率和拮抗率、UA/FLU拮抗率均存在显著异质性（均* p* < 0.001）。

6. UA+POS对敏感菌株和耐药菌株的协同效应

按临床药敏折点将全部菌株分为POS敏感（MIC ≤ 0.25 μg/mL）和POS耐药（MIC > 0.25 μg/mL）两组。62株敏感菌株中43株（69.35%）表现协同，48株耐药菌株中仅26株（54.17%）表现协同。对POS敏感菌株，UA+POS对烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、白念珠菌和皮炎外瓶霉的协同率分别达100%、100%、100%、100%和91.67%，而黑曲霉（0%，n = 1）、热带念珠菌（0%，n = 3）、耳念珠菌（0%，n = 5）和新隐球菌（0%，n = 7）几乎无协同。对POS耐药菌株，土曲霉（91.67%，11/12）和皮炎外瓶霉（100%，2/2）仍显示高协同率，黄曲霉为54.55%（6/11），白念珠菌和耳念珠菌分别为75%（3/4）和60%（3/5），而耐药烟曲霉协同率仅16.67%（1/6）。黑曲霉和新隐球菌耐药株均无协同活性。

7. UA+POS增强细胞内ROS产生

从110株菌株中随机选取9株临床分离株（7株高协同、2株非协同）进行ROS积累检测。POS单独处理显著升高所有测试菌株的细胞内ROS水平。与POS单独处理相比，UA+POS联用进一步升高了7株协同菌株中5株（293、382、121,889、130,110和PY1b）的ROS水平，而其余2株协同菌株（469和FL13）及2株非协同菌株未观察到额外升高。

8. UA+POS抑制外排泵功能

对上述9株菌株进行外排泵活性检测，结果显示在葡萄糖添加后25分钟，与POS单独处理相比，UA+POS联用显著降低了4株协同菌株（382、469、FL13和PY1b）的外排泵功能，其余菌株未见功能改变。

五、讨论与结论总结

本研究通过体外药敏试验系统证明天然产物松萝酸可作为有效的抗菌佐剂，与所有测试唑类药物联用均表现出协同效应，显著增强其对曲霉属、念珠菌属、皮炎外瓶霉和新隐球菌临床分离株的疗效。尤为突出的发现是UA+POS联用对土曲霉和皮炎外瓶霉表现出高达92.86%的协同率。然而，协同作用并非在所有菌种中普遍适用，敏感菌株与耐药菌株之间也存在差异：土曲霉和皮炎外瓶霉无论敏感性状态如何均表现广谱协同，烟曲霉的协同主要限于敏感菌株，黑曲霉、热带念珠菌、耳念珠菌和新隐球菌几乎无协同。这为针对特定真菌种类和耐药表型定制UA+POS联合策略提供了合理依据。

机制层面，UA+POS通过增强细胞内ROS积累和抑制外排泵功能发挥协同抗真菌活性。71.43%（5/7）的协同菌株在联合刺激下ROS水平显著升高，57.14%（4/7）的协同菌株表现出显著外排泵抑制，其中两株（382和PY1b）同时表现出两种机制，提示协同机制复杂且可能涉及两条通路间的交叉对话。UA+POS对POS的突出协同效应可能归因于POS的高亲脂性促进其整合入真菌膜（该过程可能被UA的膜扰动活性增强），以及POS作为多种耐药转运体的主要底物，UA的外排泵抑制作用可不成比例地使POS获益。UA+VOR和UA+FLU对新隐球菌的显著拮抗（100%和87.5%）提示应避免在隐球菌病中联用这些药物，而UA+POS和UA+ITR对新隐球菌无拮抗，进一步支持按菌种定制而非普遍应用UA-唑类联用策略。

研究人员指出研究存在局限性：证据仍处于体外阶段，临床适用性需在动物模型中确认，外排泵抑制导致胞内药物蓄积增加等机制假说有待直接实验验证。最终结论认为松萝酸是一种有前景的广谱抗真菌佐剂，UA+POS联合治疗值得优先深入研究，未来需明确其分子机制并在动物模型中验证其治疗特性，以期将该天然产物转化为应对抗真菌耐药危机的新型联合治疗策略。