基于临床样本的多组学与机器学习揭示吴茱萸（Evodia rutaecarpa）不良反应的毒性特征

《Frontiers in Pharmacology》：Multi-omics and machine learning based on clinical samples: revealing the toxicity characteristics in adverse reactions to Evodia rutaecarpa

吴茱萸（Evodia rutaecarpa，EVR）是一种临床广泛使用的低毒性中药。其不良反应通常隐蔽且具有显著的个体间差异，相关风险常被低估。本研究对其相关不良反应的代谢和微生物特征进行了多组学分析，并构建了预测模型，为个体化安全用药提供参考。

研究纳入86例接受含EVR复方制剂的胃病患者，根据有无不良反应分为对照组（n=50）和不良反应组（n=36）。分别采集血清、尿液和唾液样本进行非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）和16S rRNA测序。采用7种机器学习算法（逻辑回归、随机森林、LightGBM等）结合留一交叉验证（LOOCV）构建预测模型，筛选关键特征，并推导出多组学联合预测公式。

临床上，与EVR相关的不良事件主要表现为上消化道症状。患者样本的组学分析揭示了EVR相关不良事件与全身性变化之间的初步相关趋势，包括氨基酸代谢紊乱、神经活性分子谱改变、胆汁分泌特征改变和口腔菌群失调。机器学习筛选从多组学数据集中获得多个模型相关分类特征。血清PE（P-18:1/22:0）、羟基异己酸（hydroxyisocaproic acid）和脲基异丁酸（ureidoisobutyric acid）显示出与较低的不良事件模型预测输出相关的统计趋势。尿液中1,3-二氢-(2H)-吲哚-2-酮和MG（0:0/20:4/0:0）与预测值降低相关，而花生酰乙醇酰胺（arachidoyl ethanolamide）与模型预测评分升高相关。唾液中Granulicatella、Alysiella、Leptotrichia hongkongensis和Streptococcus的相对丰度越高，分类模型预测概率越高。研究建立了AUC加权的多组学联合公式，用于计算EVR相关不良反应的个体预测可能性。评分≥0.597表示模型预测倾向较高，而评分低于0.597表示预测可能性较低。

本研究开发的10个组学衍生判别特征和多组学联合预测公式能够定量估计个体水平EVR相关不良反应的风险。它们为低毒性中药的安全性评估、风险分层和个体化应用提供了初步参考。

论文解读

**1. 研究背景与目的**

传统中药安全性研究与监测长期聚焦于药典中明确标注为“有毒”或“大毒”的药材，因其风险界定清晰，相关事件较易识别与追踪。相比之下，药典中标注为“微毒”或“低毒”的药材在临床应用范围更广，但其不良反应表现轻微且分散，个体差异显著，相关风险常被低估，可能不以急性器官损伤为主，而是表现为低水平累积性代谢应激和相关不适症状。吴茱萸（Evodia rutaecarpa，EVR）即为这类低毒性中药的典型代表。EVR为芸香科吴茱萸属植物的成熟果实，具有镇痛、抗炎、调节胃肠动力、心脏保护、抗肿瘤和抗菌等多种生物活性，临床广泛用于胃肠功能紊乱、上消化道症状、血压异常及皮肤黏膜炎症等疾病。然而，随着临床应用扩大，其安全性问题逐渐受到关注。现有研究表明EVR毒性并非局限于单一器官，而可能累及肝、脾、肺、肾和中枢神经系统，且其多个分子单体被证实具有毒性效应。以往毒性研究多基于单一分子视角或部分器官表征，难以系统反映毒性发生的早期分子事件和个体差异。因此，亟需一种能够系统观察代谢网络整体变化并在高异质性样本中筛选稳健特征组合的研究策略。

**2. 研究内容与主要结论**

研究人员选取接受含EVR复方制剂治疗的胃病患者为研究对象，依据是否出现不良反应将受试者分为对照组（n=50）和不良反应组（n=36），对血清、尿液和唾液样本分别进行非靶向代谢组学和16S rRNA微生物组分析，进而整合机器学习技术筛选与不良反应风险密切相关的关键代谢物和微生物，建立个体化风险预测模型。研究发现，EVR相关不良反应以上消化道症状为主；多组学分析显示不良反应组存在氨基酸代谢紊乱、神经活性分子谱改变、胆汁分泌特征改变和口腔菌群失调。从血清中筛选出3个特征代谢物，尿液中筛选出3个特征代谢物，唾液中筛选出4个特征菌属。通过AUC加权融合策略构建了包含10个特征变量的多组学联合预测公式，能够对个体发生EVR相关不良反应的概率进行定量估计，为低毒性中药的安全评估和个性化用药提供了初步依据。

**3. 主要技术方法**

研究人员在2024年至2025年期间，从成都中医药大学附属医院消化科门诊及住院部筛选并纳入86例胃病患者，收集空腹血清、晨尿和刺激性唾液样本。采用UHPLC-HRMS进行血清和尿液非靶向代谢组学分析，采用16S rRNA基因测序（V3-V4区，Illumina NovaSeq 6000平台）分析唾液微生物组。数据经Compound Discoverer、QIIME2和DADA2等流程处理后，运用OPLS-DA等多元统计方法进行差异分析。机器学习部分，在统一特征选择流程（Welch’s t检验预筛→L1正则化嵌入式选择）下，横向比较逻辑回归、随机森林、LightGBM等7种分类器，采用留一交叉验证（LOOCV）评估性能，以Youden’s J确定最佳阈值，并基于各组学模型AUC值计算权重，形成多组学联合预测公式。

**4. 研究结果**

**4.1 吴茱萸水提物成分分析**

研究人员利用UHPLC-HRMS在正负离子全扫描模式下分析EVR水提物，结合保留时间、质谱数据、数据库比对和文献报道，鉴定出13种代表性化合物，主要包括黄酮类（如槲皮素、异鼠李素、儿茶素、橙皮苷）、酚酸类（如新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、没食子酸）、有机酸类（如柠檬酸）、香豆素类、醛类（如反式肉桂醛）和生物碱类（如吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱）。

**4.2 患者基线信息**

研究共纳入86例慢性胃炎相关疾病患者，平均年龄51.6±12.1岁，不良反应组36例（平均53.4±11.8岁），对照组50例（平均50.2±12.0岁）。两组性别分布和诊断疾病无统计学差异，基线可比。其中56例提供唾液样本（21例对照，35例不良反应），48例提供尿液样本（13例对照，35例不良反应），52例提供血清样本（16例对照，36例不良反应）。

**4.3 血清代谢组学分析**

对52例患者血清进行非靶向代谢组学分析，OPLS-DA模型验证显示模型有效且未过拟合。负离子模式下有411个代谢物下调、418个上调，正离子模式下有261个下调、673个上调。KEGG富集分析显示差异代谢物显著富集于ABC转运蛋白、精氨酸和脯氨酸代谢、神经活性配体-受体相互作用等通路，此外还涉及酪氨酸代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成等。提示不良反应组存在氨基酸代谢和神经活性相关通路的关联性改变。

**4.4 尿液代谢组学分析**

对48例患者尿液进行非靶向代谢组学分析，OPLS-DA模型显示两组样本存在一定分离趋势，模型预测能力良好。负离子模式中157个代谢物上调、417个下调，正离子模式中513个下调、246个上调。KEGG富集分析显示差异代谢物主要富集于胆汁分泌、精氨酸和脯氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、酪氨酸代谢等通路。表明不良反应组尿液代谢改变主要与胆汁酸代谢、多种氨基酸代谢和神经信号转导相关。

**4.5 唾液微生物组分析**

对56例患者唾液进行16S rRNA测序，α多样性分析显示不良反应组Simpson指数显著降低（P=0.013），Shannon指数略降，Chao1和ACE指数无显著差异，提示菌群均匀度下降、优势菌群更集中。β多样性分析显示两组在PCoA空间中重叠较多，仅中心位置略有偏移，ANOSIM分析显示整体结构差异不显著。LEfSe分析（LDA>2）显示不良反应组中放线菌门、棒状杆菌属、罗氏菌属和链球菌属相对丰度增加。PICRUSt2功能预测提示氨基酸代谢（精氨酸、脯氨酸、色氨酸代谢）、细菌趋化性和生物膜形成通路富集增强，而短链脂肪酸生物合成通路富集减弱。

**4.6 患者EVR不良反应的整体代谢网络**

综合血清、尿液和唾液多组学富集分析，不良反应组主要涉及氨基酸代谢、神经活性、物质转运与吸收相关改变。氨基酸改变集中于丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成和色氨酸代谢；多数氨基酸及其中间代谢物丰度升高，而部分支链氨基酸分解产物和色氨酸下游代谢物降低。神经活性相关通路中，兴奋性神经递质（谷氨酸、乙酰胆碱）水平升高，抑制性神经递质（如多巴胺）和激素（如皮质醇）水平降低。ABC转运蛋白和矿物质吸收通路富集模式也发生关联改变，提示跨膜转运和全身氮稳态存在相应变化。

**4.7 基于多组学数据的机器学习模型预测性能筛选**

研究在统一特征选择流程下比较了7种机器学习模型的LOOCV性能。唾液微生物组中随机森林模型最优（AUC=0.842），其次为KNN（AUC=0.829）；血清代谢组学中逻辑回归最优（AUC=0.976），特异度0.938，敏感度0.917；尿液代谢组学中LightGBM最优（AUC=0.930），排除外源性代谢物后敏感度0.886，特异度1.000，平衡准确度0.943。最终部署模型为：血清代谢组学-逻辑回归、尿液代谢组学-LightGBM、唾液微生物组-随机森林。

**4.8 关键代谢物筛选与预测模型构建**

基于各部署模型的特征重要性分析，共筛选出10个模型关联判别特征。血清代谢组学：PE（P-18:1/22:0）、羟基异己酸、脲基异丁酸，三者回归系数均为负，即浓度升高对应模型预测不良反应概率降低。尿液代谢组学：1,3-二氢-(2H)-吲哚-2-酮（色氨酸-犬尿氨酸通路下游代谢物）、花生酰乙醇酰胺、MG（0:0/20:4/0:0）其中花生酰乙醇酰胺权重为正，其余两个特征与预测风险负相关。唾液微生物组：Granulicatella、Alysiella、Leptotrichia hongkongensis和Streptococcus，其相对丰度升高会增加模型预测的不良反应概率。基于AUC权重融合，血清代谢组学贡献38.1%，尿液代谢组学贡献34.5%，唾液微生物组贡献27.4%。最终建立联合预测公式：P_ADR=0.381·P_S+0.345·P_U+0.274·P_M，判别阈值为0.597。得分≥0.597提示模型预测高风险，低于0.597提示低风险。

**5. 讨论与结论**

讨论部分指出，EVR不良反应在临床上常被低估，本研究通过多组学整合发现了与不良反应相关的系统性分子和微生物变化。血清特征代谢物可能反映膜稳定性、能量代谢和核苷酸代谢的宏观改变；尿液特征与神经活性分子和免疫调节相关；唾液菌属均为机会致病菌，其丰度变化可能与局部炎症和全身代谢紊乱有关。AUC加权融合公式为个体化风险分层提供了探索性定量框架，但该模型尚不能直接用于临床，需在大样本独立队列中验证。研究局限性包括：样本量较小且各组学子集不完全重合，存在混杂因素（合并用药、基础疾病等），且患者均服用含EVR复方制剂，无法完全归因于单味EVR，所得结论为相关性而非因果性。

结论：本观察性研究确定了与含EVR复方制剂暴露患者不良事件可能相关的全身性分子和微生物特征，包括氨基酸代谢、神经活性分子稳态、胆汁分泌通路和口腔微生物组成的变化。血清中识别出3个模型关联判别特征：PE（P-18:1/22:0）、羟基异己酸和脲基异丁酸；尿液中识别出1,3-二氢-(2H)-吲哚-2-酮、MG（0:0/20:4/0:0）和花生酰乙醇酰胺；唾液微生物组中识别出Granulicatella、Alysiella、Leptotrichia hongkongensis和Streptococcus作为关键微生物群落。通过AUC加权融合策略建立了多组学整合预测公式，评分≥0.597表示服用含EVR复方制剂患者出现胃肠道不良结局的模型预测概率较高。该模型可对个体患者的不良反应预测概率进行统计量化，为低毒性中药的安全性评估和风险分层提供初步参考。