鞘液毛细管电泳-天然自上而下质谱（CE-nTDMS）探测膜蛋白-脂质非共价相互作用并定位心磷脂结合区

《Analyst》：Probing non-covalent membrane protein–lipid interactions using sheath liquid capillary electrophoresis-native top-down mass spectrometryOpen Access

探测非共价膜蛋白–脂质相互作用仍然具有挑战性，这是由于膜蛋白的高疏水性和聚集倾向。在此，研究人员提出了一种鞘液毛细管电泳-天然自上而下质谱（sheath liquid capillary electrophoresis-native top-down mass spectrometry, CE-nTDMS）平台，该平台能够可重复地输注水通道蛋白Z-心磷脂（aquaporin Z-cardiolipin, AqpZ-CDL）组装体，并在自上而下碎裂过程中保留其非共价静电相互作用。该工作流产生了一个诊断碎片离子，可在蛋白质主链内定位脂质结合区域。值得注意的是，在碰撞活化后，脂质结合组装体的电荷还原前体碎片离子表现出不对称的同位素分布，而相应的脱辅基前体则显示对称的同位素分布。这些发现证明了CE-nTDMS在可靠分析膜蛋白–脂质组装体方面的效用，并为脂质结合碎片在碰撞活化过程中的行为提供了新见解。

膜蛋白–脂质相互作用是细胞功能、膜组织和药物作用的基本决定因素。跨膜蛋白（例如G蛋白偶联受体、离子通道和转运蛋白）跨越磷脂双层，依赖其脂质环境维持结构完整性和调节活性。脂质不仅是结构基质，也是控制蛋白质构象、动力学和信号传导的调节剂。多种小分子治疗药物在蛋白质-脂质界面作用于靶点，表明周围脂质的理化性质可影响结合能量学、疗效和脱靶效应。尽管具有基础生物学重要性，非共价膜蛋白–脂质相互作用仍难以表征，因为它们通常较弱、异质且瞬态，是膜蛋白化学中了解最少的方面之一。X射线晶体学、冷冻电子显微镜（cryogenic electron microscopy, cryo-EM）和核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）以及计算工具已显示一定能力用于膜蛋白–脂质相互作用的结构分析。然而，仍需要互补工具以可靠地在精细结构细节上定义这些关系。例如，天然质谱（native mass spectrometry, nMS）已成为这些生物物理工具的强大补充，用于分析膜蛋白–脂质相互作用。生物信息学、增溶膜蛋白的去垢剂胶束和质谱仪器的进展，使nMS可用于研究完整膜蛋白–脂质相互作用。近期，nMS已与自上而下质谱（top-down mass spectrometry, TDMS）联用。在单次实验中，这种方法称为“天然自上而下质谱（native TDMS, nTDMS）”，可提供关于蛋白质组装体构型（nMS）和蛋白质一级序列结构偏差（例如翻译后修饰[posttranslational modifications, PTMs]和截短）的独特信息。然而，该领域许多发展集中于可溶性蛋白。尽管文献相对稀少，碎裂技术进展（例如红外多光子解离[infrared multiphoton dissociation, IRMPD]、紫外光解离[ultraviolet dissociation, UVPD]、电子捕获解离[electron-capture dissociation, ECD]联合或不联合高能碰撞解离[higher-energy collision dissociation, HCD]）已扩展nTDMS对膜蛋白的适用性。尽管如此，这些技术大多难以实施、缺乏广泛商业可用性或产生高度复杂的串联质谱谱图。虽然nTDMS已改变研究人员表征蛋白质形式和其复合物的能力，但其探测非共价膜蛋白–脂质相互作用的能力仍在发展。例如，Sipe et al.报道了使用UVPD增强膜蛋白–脂质组装体表征，但由于缺乏保留完整脂质的holo碎片离子，脂质结合位点的确定定位受到限制。解析这些相互作用对于捕获脂质依赖性结构调控的全貌至关重要。然而，保留和定位非共价结合的脂质仍具挑战性，因为其不稳定且同一蛋白质中存在多个结合位点。此外，膜蛋白聚集和沉淀进一步使分析复杂化，需要改进增溶和nTDMS工作流。尽管质谱友好的去垢剂胶束已扩展天然MS对膜蛋白的分析，样品引入仍是关键瓶颈。常规直接输注平台用于完整蛋白分析常面临喷雾不稳定、堵塞、聚集、表面吸附和长时间测量中蛋白质沉淀等挑战。毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）通过提供受控样品递送、喷雾稳定性和与低体积生物样品的兼容性，有利于解决这些限制。研究人员先前表明，CE与鞘液质谱接口联用可实现可溶性蛋白组装体的稳健且可重复输注。在此，研究人员将该技术扩展至输注膜蛋白–脂质组装体，并在蛋白质主链内定位脂质结合区和PTM。使用水通道蛋白Z（aquaporin Z, AqpZ）和心磷脂（cardiolipin, CDL）作为模型系统，研究人员评估优化的CE-nTDMS条件在气相活化期间保留膜蛋白形式及其蛋白修饰复合物（“复合物形式”[complexoforms]）上不稳定非共价脂质相互作用的能力。样品制备和数据采集/分析在补充信息中详细描述。简言之，CE-nTDMS平台被设计用于：(i)从去垢剂胶束释放膜蛋白，(ii)从高阶组装体释放单体蛋白形式，(iii)保留不稳定非共价脂质相互作用，(iv)表征脂质结合区和PTM。研究人员使用优化的脱溶剂电压、结合源内碰撞诱导解离（collision-induced dissociation, CID）-HCD的伪MS³策略和基于TDValidator的分配，比较脂质结合样品和对照样品的holo产物离子。该框架识别出一个与先前报道的非共价CDL结合位点一致结合区，并检测到AqpZ N端一个先前报道的PTM。在该CE-nTDMS工作流中，鞘液CE-MS平台提供了优异的喷雾稳定性以及温度和流速的精确控制，实现了高度可重复的nTDMS分析。采用中性涂层毛细管以最小化膜蛋白组装体的非特异性吸附。三次重复测量，每次重复3分钟MS采集，能够对holo碎片离子进行严格的跨运行评估，证明可重复检测与结构特征一致，而非随机噪声。脱溶剂电压（desolvation voltage, DV）为?200 V时产生低电荷态分布，确认类天然拓扑。高效脱溶剂对于从去垢剂胶束释放AqpZ至关重要。完整AqpZ四聚体测得98 210 Da，与理论质量98 214 Da接近，理论质量考虑了每个单体蛋白形式的N端甲酰基和His标签。为增强序列覆盖度，应用了伪MS³方法。?200 V的DV诱导受控亚基喷射，允许分离7⁺电荷态（单体蛋白形式）用于30 V的HCD碎裂。所得伪MS³谱图使用ProSight Lite处理，分配的b型和y型碎片离子被突出显示。该工作流产生约11%的序列覆盖度。这些结果证明CE-nTDMS用于膜蛋白复合物形式结构检查的稳健性。此外，这些数据集显示，CE-nTDMS工作流在喷射单体蛋白形式亚基并碎裂它们的同时，保留了完整膜蛋白组装体。该方法产生高保真指纹谱图，揭示膜复合物形式中单体蛋白形式的组成和组织。在优化关键MS参数（例如DV和碰撞能量）后，AqpZ与CDL孵育。天然MS¹谱图揭示四聚体AqpZ组装体非共价结合CDL的高效气相转移。对于复合物形式的16⁺、15⁺和14⁺电荷态，观察到非共价脂质结合。即使在DV为?200 V时，CDL仍与单体蛋白形式亚基保持关联。在更高负DV（例如?250 V）下，不再观察到CDL与单体亚基结合。单体蛋白形式亚基从AqpZ四聚体复合物形式中喷射，生成8⁺、7⁺和6⁺电荷态。聚焦于低丰度AqpZ-CDL峰（3716 m/z，[+7]），采用宽隔离窗口、高μscan数、高平均次数和长进样时间以有效捕获该m/z物种。该离子随后通过源内CID-HCD进行伪MS³分析。需要30 V的HCD碰撞能量以保留CDL与AqpZ结合。在更高能量（例如35 V）下，CDL不再保留在蛋白质主链上。单体AqpZ-CDL蛋白形式携带N端甲酰化和His标签，这可能通过影响折叠和稳定性而影响蛋白质拓扑。重要的是，非共价脂质相互作用在活化期间得以保留。在所有重复的去卷积伪MS³谱图中一致观察到CDL前体质量，提供了CDL保留的直接证据。这表明AqpZ与CDL之间存在强静电接触，在此情况下可抵抗自上而下碎裂。使用TDValidator软件从每个样品的伪MS³谱图生成AqpZ-CDL和未处理AqpZ的碎裂图。重要的是，对CDL处理和未处理样品应用相同的源内CID（15 V）和HCD（30 V）条件，以便直接比较其碎裂模式。来自CDL处理和未处理样品的两个伪MS³谱图均使用TDValidator软件按照相同工作流独立处理，以确保一致的碎片分配。CDL处理样品实现了约18%的序列覆盖度，未处理样品显示约15%的序列覆盖度。这些解离条件产生了一个holo碎片（b₂₂⁶）离子，其电荷态范围为⁺⁴至⁺⁸，保留了完整磷脂。该诊断离子表现出与一个CDL结合一致的质量偏移，并能够在蛋白形式一级序列内定位脂质结合区。holo b₂₂⁶离子的质量根据其同位素包络、质量误差（≤10 ppm）、同位素拟合评分（≥0.5）和其⁺⁴至⁺⁸电荷态的信噪比（>3）进行评估。所有这三个AqpZ-CDL重复中均观察到所有这些电荷态。TDValidator检测到其他holo产物离子。然而，它们的同位素分布谱不足以支持可靠分配，因此被丢弃。尽管满足TDValidator阈值，人工检查显示这些离子要么埋藏在谱图中，受邻近峰干扰影响，在CDL处理和未处理样品中均存在，或在一个或多个三个重复中缺失。值得注意的是，对应于holo碎片离子（b₂₂⁶）⁺⁶至⁺⁸电荷态的峰在未处理AqpZ重复中检测不一致，且被TDValidator分配为内部碎片离子。其差的可重复性和未处理样品中CDL的缺失表明这些峰与CDL结合无关。在此，研究人员仅在所有技术重复中观察到所有电荷态时，才将产物离子视为真阳性。相反，对应于⁺⁴和⁺⁵电荷态的峰仅在AqpZ-CDL样品中检测到，并在所有三个重复中一致观察到。这两个电荷态提供了CDL相关b₂₂⁶碎片离子的证据，支持一个涵盖残基K₄、W₁₄、R₇₅和R₂₂₄的脂质结合区。这些结合位点的分配得到先前nMS和诱变研究的支持，这些研究鉴定了这些脂质相互作用残基。重要的是，要精确映射结合位点，需要接近完整的序列覆盖度或跨越修饰残基的holo碎片离子。除了脂质结合事件的瞬态性质外，nMS研究中的去垢剂具有脱脂效应，可破坏这些相互作用。因此，识别结合区并将这些发现与先前诱变和分子建模研究整合，为阐明膜蛋白中的脂质调控提供了有力框架。先前研究表明，基于CID的碎裂可在非共价配体定位中引入假象，特别是配体迁移。与这一现象一致，holo碎片（b₂₂⁶ [⁺⁴和⁺⁵]）离子和电荷还原前体碎片离子在实验与理论同位素分布之间显示出细微但可重复的偏差。相反，apo电荷还原前体碎片离子显示完美匹配。高分辨串联MS确认CDL部分在活化期间保持完整，排除了其降解作为观察到的同位素不对称的来源。结构映射将CDL结合定位到AqpZ四聚体胞质面上的保守界面基序，涉及一个亚基的R₂₂₄和R₇₅邻近相邻亚基的K₄和W₁₄，与跨四聚体界面的亚基间CDL相互作用位点一致。这些在CE-nTDMS鉴定的结合区内残基已知与CDL相互作用并有助于AqpZ稳定和功能。这些位点的亚基间定位与先前研究将AqpZ-CDL相互作用映射到相同区域一致。这种排列形成静电和亚基间稳定相互作用，其中W₁₄提供关键锚定接触。因为HCD依赖微秒时间尺度上的逐步、多次碰撞事件，主链断裂所需能量可能扰动这些非共价相互作用。尽管CDL在HCD碎裂期间保持完整，蛋白形式亚基的部分去折叠可能使脂质在暴露表面发生瞬态重定向。这种重排可改变阳离子残基（K₄、R₇₅和R₂₂₅）与阴离子CDL头基之间的质子迁移和电荷分配。这些阳离子残基聚集在AqpZ胞质侧。W₁₄是已知CDL相互作用残基和AqpZ四聚体稳定元件。其突变为丙氨酸促进CDL更深穿透亚基间界面。同时，CDL酰基链可能与非特异疏水相互作用与不稳定区域结合，增加构象异质性。这些效应共同产生具有相同元素组成但质子化拓扑不同的微观异质holo碎片离子群体。完整CDL的保留进一步拓宽构象集合，可能加速Orbitrap分析器内的瞬态衰减和相位相干损失，产生观察到的扭曲同位素模式。相反，apo电荷还原前体碎片离子缺乏CDL介导的结构和电子异质性，因此符合理论同位素分布。总之，该CE-nTDMS工作流建立了用于将膜蛋白–脂质组装体引入质谱仪的鞘液CE-MS接口。该接口实现了高效且可重复的nTDMS分析，克服了常规直接输注平台的限制。该工作流能够对脂质结合蛋白形式和复合物形式进行高分辨分析，并通过结合源内CID与HCD的伪MS³策略定位脂质结合区。保留一个完整磷脂分子的诊断holo碎片离子提供了关于更广泛脂质相互作用区的见解。TDValidator检测到的其他holo碎片离子因谱图质量模糊而被排除。研究人员将这种谱图复杂性归因于CID诱导的碎裂效应、重叠的同位素分布、共隔离的碎片离子、谱图拥挤和来自去垢剂胶束的化学噪声。结果表明，AqpZ与CDL之间的静电相互作用在HCD碎裂下持续存在，表明气相中稳定的脂质–蛋白接触。观察到的同位素不对称表明磷脂保留在碎裂期间施加结构和电子约束，与天然AqpZ四聚体内CDL稳定的胞质亚基间模式一致。完全残基水平解析将需要高或完整序列覆盖度，包括侧翼脂化残基的holo碎片。此外，检测额外的更短holo碎片将进一步缩小脂质相互作用区，并能够更精确地鉴定单个脂质结合位点。此处展示的结果证明了CE-nTDMS表征膜蛋白–脂质组装体的可行性，并为未来旨在更精确定位脂质结合位点的研究奠定了基础。总体而言，这项工作建立了在自上而下碎裂期间保留和验证脂质结合区的框架，代表了朝着阐明脂质介导的膜蛋白调控的重要进展。