新型人参皂苷衍生物OCLA通过抑制HIF1α介导的糖酵解代谢保护对乙酰氨基酚诱导肝损伤的研究

《Frontiers in Pharmacology》：Design, synthesis of a novel ginsenoside derivative and its protection against acetaminophen induced liver injury via suppressing HIF1α-mediated glycolytic metabolism

　　

背景：对乙酰氨基酚（APAP）过量是药物性肝损伤（DILI）的主要原因。受(20S,24R)-ocotillol（OC）和硫辛酸（LA）协同保肝作用的启发，研究人员设计并合成了一种新型人参皂苷衍生物OCLA，该化合物已获得专利授权。方法：通过高分辨质谱（HRMS）、¹H核磁共振波谱（¹H NMR）和¹³C核磁共振波谱（¹³C NMR）确认OCLA的结构。在体外评估了OCLA对APAP诱导的HepG2细胞死亡的保护作用。在体内，研究人员给予小鼠32 mg/kg OCLA，随后检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）/天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平、肝脏总谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、GSH/GSSG比值以及肝组织病理学损伤。此外，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定OCLA在小鼠血浆和肝组织中的药代动力学参数。整合转录组学和代谢组学测序，结合分子对接和细胞热位移分析（CETSA）实验，以识别关键通路和结合靶点。结果：在体外，OCLA对APAP诱导的HepG2细胞死亡的保护作用优于OC。在体内，OCLA预处理显著减轻了APAP诱导的血清ALT/AST升高，恢复了肝脏GSH/GSSG氧化还原稳态，并改善了组织病理学肝损伤。药代动力学分析显示OCLA具有显著的肝脏蓄积，其在肝脏中的AUC和C_max显著高于血浆。整合组学分析确定HIF1α信号通路是OCLA的关键靶点。分子对接和CETSA进一步表明OCLA直接靶向HIF1α，抑制其表达，从而阻断HIF1α介导的糖酵解相关基因表达（GLUT1、HK1、HK2、PFKL、PFKFB3、ENO1）、炎症反应（IL-6、TNF-α）和凋亡相关蛋白表达。结论：OCLA预处理主要通过抑制HIF1α相关的糖酵解相关分子特征和炎症反应的失调，对APAP诱导的肝损伤发挥保护作用，显示出预防药物性肝损伤的广阔潜力。

对乙酰氨基酚（APAP）过量是药物性肝损伤（DILI）的常见原因，可导致急性肝衰竭。N-乙酰半胱氨酸是目前唯一的解毒药物，但其治疗时间窗有限。因此，寻找更有效的防治策略至关重要。人参皂苷衍生物ocotillol（OC）和天然抗氧化剂硫辛酸（LA）均具有保护肝脏的药理活性，且研究人员前期发现两者联用对APAP诱导的肝损伤具有协同保护作用。基于此，研究人员设计并合成了新型衍生物OCLA，并申请了专利。本文旨在阐明OCLA保护APAP诱导肝损伤的药效及分子机制，为药物性肝损伤的防治提供新候选化合物。

研究人员首先通过化学合成获得OCLA，并利用HRMS、¹H NMR和¹³C NMR确证其结构。体外实验表明，OCLA保护APAP诱导的HepG2细胞死亡的效果优于OC。体内实验中，40只雄性ICR小鼠（购自长春懿司实验动物科技有限公司，吉林，中国）随机分为对照组、模型组、OCLA低剂量组（16 mg/kg）、OCLA高剂量组（32 mg/kg）和水飞蓟素组（32 mg/kg），OCLA腹腔注射7天，第8天腹腔注射350 mg/kg APAP建立急性肝损伤模型。结果显示OCLA高剂量组显著降低血清ALT/AST水平，恢复肝脏GSH/GSSG比值，改善肝组织病理损伤。药代动力学分析表明，OCLA腹腔注射后在肝脏中的AUC和C_max分别为血浆的约6.3倍和约1.9倍，显示明显的肝靶向蓄积特性。整合转录组学和代谢组学分析发现，HIF1α信号通路是OCLA调控的核心靶点。分子对接和CETSA实验证实OCLA可直接结合HIF1α蛋白。进一步实验表明，OCLA通过抑制HIF1α表达，下调其下游糖酵解相关基因（GLUT1、HK1、HK2、PFKL、PFKFB3、ENO1）以及炎症因子（IL-6、TNF-α）和凋亡相关蛋白（p21、Bax/Bcl2、p65）的表达，从而减轻APAP诱导的肝损伤。

主要关键技术方法包括：化合物合成与结构鉴定（HRMS、NMR）、CCK-8细胞活力测定、动物实验（ICR小鼠，APAP诱导肝损伤模型）、血清ALT/AST生化检测、H&E染色、GSH/GSSG试剂盒测定、UPLC-MS/MS药代动力学分析、RNA-seq转录组测序、UHPLC-Q-TOF/MS代谢组学测序、qRT-PCR、Western blot、分子对接（CB-DOCK2平台）及CETSA实验。样本来源为上述小鼠肝组织和HepG2细胞。

研究结果分述如下：

**3.1 新型(20S,24R)-ocotillol硫辛酸衍生物的合成**：APAP作用于HepG2细胞的IC₅₀为10.432 mM，故选用10 mM APAP造模。Combenefit分析显示OC与LA在低于5–25 μM浓度下联合应用有协同保护作用。据此设计并合成OCLA，通过NMR和HRMS确认结构为C₃₈H₆₄O₆S₂。CCK-8结果显示OCLA保护效果显著优于OC。

**3.2 OCLA减轻APAP诱导的体内肝损伤**：在ICR小鼠模型中，OCLA预处理显著抑制APAP引起的ALT/AST升高（高剂量组尤其明显），改善肝组织病理损伤，并呈剂量依赖性地恢复肝内GSH含量和GSH/GSSG比值，降低GSSG蓄积。药代动力学显示OCLA在血浆和肝组织中均在0.5 h达峰，肝组织AUC_0-t为15842.24 ng·h/g，血浆为2518.69 ng/L·h，肝/血浆AUC比约为6.3，且OCLA在肝内平均滞留时间（3.22 h）长于血浆（1.70 h），证实OCLA原形分子可显著分布并蓄积于肝脏。

**3.3 OCLA预处理后肝脏差异表达基因的变化**：RNA-seq分析显示，APAP组与对照组相比有3923个差异表达基因（DEGs），其中上调2383个、下调1540个；OCLA组与APAP组相比有3795个DEGs（上调1662个、下调2133个）。取APAP上调而OCLA下调的DEGs共1620个，APAP下调而OCLA上调的DEGs共841个。GO富集显示这些基因参与“细胞过程”“生物调节”“代谢过程”等。KEGG分析表明APAP上调而OCLA下调的DEGs显著富集于IL-17、TNF、MAPK、HIF-1及NF-κB等炎症与凋亡相关通路，而APAP下调且OCLA上调的DEGs富集于药物代谢相关的细胞色素P450通路。

**3.4 OCLA预处理后肝脏代谢物谱的改变**：代谢组学共鉴定991种代谢物，其中脂类（33.06%）、有机酸及衍生物（22.28%）、有机杂环化合物（14.72%）为主。PCA和OPLS-DA分析表明，APAP组与对照组、OCLA组与APAP组的代谢谱均有显著差异。

**3.5 OCLA通过调节代谢过程减轻APAP诱导的肝损伤**：差异代谢物KEGG富集显示，APAP导致的代谢紊乱主要涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，核黄素代谢，视黄醇代谢及色氨酸代谢；OCLA逆转的代谢物主要富集于亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和核黄素代谢。其中，19个差异代谢物被APAP上调且被OCLA下调，7个被APAP下调且被OCLA上调。

**3.6 OCLA靶向HIF1α并下调糖酵解信号**：通过转录组和代谢组联合分析，共交集9条信号通路，其中只有HIF1α信号通路在两种组学中均显著富集。STRING数据库显示HIF1α与糖酵解酶HK1/2、ENO1、PFKL、PFKFB3，炎症介质TNF-α、p65、IL-6及凋亡蛋白p21存在互作。分子对接显示OCLA与HIF1α蛋白结合能达?7.3，CETSA实验证实10 μM OCLA可增强HIF1α蛋白的热稳定性，表明二者存在直接结合。

**3.7 OCLA通过抑制HIF1α介导的糖酵解代谢减轻肝损伤**：qRT-PCR显示APAP上调HIF1A、HK1、PFKL、ENO1、PFKFB3、CDKN1A、IL-6、Rela和TNF的mRNA表达，OCLA预处理则显著逆转。Western blot结果证实OCLA降低HIF1α、磷酸化p65、Bax/Bcl2及p21蛋白水平。此外，在APAP损伤的HepG2细胞中加入HIF1α抑制剂cyclo(CLLFVY)，可显著削弱APAP诱导的炎症和凋亡相关蛋白上调，进一步验证靶向HIF1α的保肝机制。

讨论部分作者指出，APAP过量是DILI常见病因，现有治疗存在局限。OCLA基于OC与LA协同作用而设计，其保肝效果优于母体化合物。组学分析将HIF1α信号通路确认为OCLA的核心靶点，该通路与炎症、代谢紊乱和细胞凋亡密切相关。实验证实OCLA直接结合HIF1α并抑制其表达，进而下调HIF1α转录调控的糖酵解酶和炎症因子，恢复代谢稳态。但本研究为预防性给药方案，OCLA对APAP过量后的治疗性效果尚需进一步验证；同时腹腔注射与口服的生物利用度差异，以及体内酯酶对OCLA的潜在水解作用仍需后续研究。

研究结论：OCLA预处理主要通过抑制HIF1α相关的糖酵解相关分子特征和炎症反应的失调，对APAP诱导的肝损伤发挥保护作用，显示出预防药物性肝损伤的广阔潜力。