基于固相萃取柱在线分馏的多模态质谱脂质分析方法

《Analyst》：A multi-modal mass spectrometric approach for lipid analysis enabled by online fractionation of complex mixtures in a solid-phase extraction cartridgeOpen Access

本研究旨在开发一种利用固相萃取（SPE）柱分析复杂脂质混合物的直接进样分析平台。该SPE柱由研究人员自行制备并与封闭式电喷雾电离（cESI）源耦合，实现了脂质的在线分馏及洗脱液的实时质谱（MS）分析。SPE柱填充了硅胶吸附剂。研究人员使用多种极性不同的溶剂依次洗脱并表征不同脂质。为稳定非极性有机溶剂的电喷雾信号，该SPE-cESI-MS平台采用同轴喷雾系统，允许从第二个电喷雾毛细管输送含有乙酸铵的脂肪酶。在最完整的实施中，SPE-cESI-MS平台被应用于分馏包含18种不同脂质的样品混合物，依次使用己烷、乙醇和水从硅胶吸附剂上洗脱。三个洗脱步骤共使混合物中93.0%的脂质被检测到，且信号强度整体提升。相比之下，若没有微型化SPE前端，对18组分脂质混合物的直接分析仅能检测到85.7%的脂质。研究人员通过评估溶剂对极性和非极性脂质的选择性，对所用溶剂进行了优化。非极性脂质（如三亚油酸甘油酯）从极性硅胶表面洗脱的检测限为0.62 μM，而极性油酸从相同吸附剂洗脱的检测限为0.84 μM。这项工作代表了一种快速且经济的分析方法，适用于无法使用传统色谱的情况下的复杂脂质混合物分析，包括在便携式质谱仪上的分析。

研究背景与问题

过去十年，脂质组学研究取得了显著进展，极大地提升了研究者表征脂质多样性并阐明其在健康与疾病中作用的能力。脂质组是代谢组中高度动态且富含信息的组成部分，微小的脂质组学改变常发生在可检测的临床症状之前，为疾病的早期发现、预后评估和治疗监测提供了可能。然而，脂质作为一类多样的生物分子，其结构复杂性与其功能密切相关。极性、不饱和度、头基和酰基链长度等因素均会影响脂质及其在人体内的作用。尽管质谱（MS）是分析脂质的常用方法，能够提供详细的分析信息，但在离子化和表征某些特定类别脂质以及区分异构体方面仍面临挑战，这主要是由于低极性和相同的质荷比（m/z）。例如，三酰甘油（TG）是体内最常见的脂质类别，也是最难通过MS检测的。传统的分离技术如液相色谱（LC）和气相色谱（GC）虽然能提供灵敏且高质量的分离，但需要耗时的样品准备和较长的运行时间，在资源有限的条件下难以实施。因此，研究人员试图开发一种基于SPE平台的微型化分离系统，使其不仅能作为样品前处理步骤，还能通过控制溶解度并使用合适的洗脱溶剂来分离不同类别的脂质。

研究内容与结论

研究人员开发并优化了一种填充硅胶吸附剂的SPE柱，并将其与同轴封闭式电喷雾电离（cESI）源无缝结合，构建了一个微型化分离系统，用于在ESI-MS分析过程中实时分馏脂质混合物。该系统利用同轴喷雾系统和乙酸铵溶液，使通常不利于电喷雾的有机溶剂也能产生稳定的信号。通过在乙酸铵溶液中加入脂肪酶，利用微滴化学加速的水解反应，在一次质量分析中即可获得更多有助于物种鉴定的信息。在对二元混合物的分析中，该方法展示了极高的分馏选择性。对于包含18种脂质的复杂混合物，通过依次使用己烷、乙醇和水三种不同溶剂进行顺序分馏，实现了93%的检测效率。相比之下，在不使用SPE柱的情况下直接进样分析同一混合物，检测效率降至85.7%。该研究通过优化溶剂极性和pH值，改变了不同脂质的溶解度和分析物性质，从而实现了选择性洗脱和吸附。非极性脂质（三亚油酸甘油酯）从硅胶吸附剂上洗脱的检测限为0.62 μM，高于极性脂质（油酸）的0.84 μM。这项研究表明，经过充分优化后，该方法可作为一项快速、稳健的分析技术，在资源有限条件下实现对复杂混合物的直接分析，尤其适用于与便携式质谱仪的结合。

关键技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）自制固相萃取（SPE）柱：使用1 mL一次性注射器，内填0.1 mL未改性硅胶吸附剂，两端由聚乙烯筛板固定，并通过16号不锈钢针头连接至封闭式电喷雾电离（cESI）源；2）同轴封闭式电喷雾电离（cESI）源：基于Swagelok十字接头构建，通过两根去活熔融石英毛细管分别引入脂质提取物和含脂肪酶的乙酸铵溶液，在N₂载气（100 PSI）作用下形成微滴并传输至质谱仪；3）在线脂肪酶水解反应：在微滴环境中，脂肪酶催化洗脱脂质的水解，产生诊断性离子，辅助结构表征；4）顺序溶剂洗脱策略：针对18种脂质混合物，依次使用己烷、乙醇和水三种极性递增的溶剂从SPE柱上分步洗脱不同极性的脂质；5）质谱分析：所有质谱数据使用Thermo Fisher Scientific Velos Pro离子阱质谱仪采集，喷雾电压为±5 kV，溶剂流速为10 μL min^-1。

研究结果

脂质水解：研究人员首先分析了三种TG脂质——三亚油酸甘油酯、三油酸甘油酯和三亚麻酸甘油酯。将脂质与含脂肪酶的乙酸铵溶液同轴喷雾，在正离子模式下观察到完整的脂质铵加合物[M + NH₄]⁺及其水解产生的溶血形式，在负离子模式下则检测到对应脂肪酸的信号。这表明脂肪酶诱导的脂质水解是以逐步方式进行的，而非协同机制。与不含脂肪酶的对照实验相比，脂肪酶的存在显著增强了非极性脂质的检测能力，并提供了结构诊断信息。

二元混合物：使用由三亚油酸甘油酯（非极性）和油酸（极性）组成的二元混合物验证系统的分离能力。将两种脂质分别加载到SPE柱上，先用含1%氢氧化铵的己烷洗脱非极性的三亚油酸甘油酯，再用甲醇洗脱极性的油酸。结果显示，己烷洗脱液中仅检测到三亚油酸甘油酯及其水解产物亚油酸，无油酸信号；随后的甲醇洗脱液则只检测到高强度的油酸信号。该实验实现了100%的分离选择性，证实了SPE柱上基于极性差异的脂质分馏可行性。

复杂混合物分析：将方法应用于包含18种脂质（含TG、磷脂等）的复杂混合物分析，模拟从生物样品中提取的脂质。采用三级在线萃取系统，依次使用己烷、乙醇和水进行洗脱。己烷洗脱主要得到最非极性的TG脂质（如三油酸甘油酯和三棕榈油酸甘油酯）。乙醇洗脱步骤检测到的脂质种类最多，在正离子模式下检测到包括TG、磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰甘油（PG）在内的13种脂质，占14个独特质量信号的11个，检测效率达78.5%；负离子模式还检测到了PG和磷脂酰乙醇胺（PE）的去质子化形式。水洗脱步骤主要检测到PE脂质，以及先前步骤中未完全洗脱的TG和PG脂质，更重要的是，检测到了脂肪酶水解产生的游离脂肪酸（如油酸、亚油酸等），这些信号在前两步中未被观察到。通过三步洗脱，共检测到17种脂质（13/14个独特信号），检测效率达到93%。

不使用SPE柱的直接进样：作为对比，研究人员在不使用SPE柱的情况下，直接将18种脂质的混合物溶于己烷后进行同轴喷雾分析。正离子模式检测到8个独特信号（12种脂质），负离子模式额外检测到4种脂质，合计12/14个独特信号，检测效率为85.7%。与使用SPE柱的93%检测效率相比，表明SPE前端分馏有效降低了离子抑制效应，提高了信噪比和总体信号水平。

方法优化：研究人员对洗脱溶剂、电喷雾参数（喷雾电压、流速、雾化气压力）进行了系统优化。结果表明，己烷是洗脱非极性TG脂质的最佳溶剂，甲醇是洗脱极性PE脂质的最佳溶剂。通过在己烷中添加1%氢氧化铵，可以有效减少极性脂质（如油酸）在非极性洗脱步骤中的共洗脱。最佳电喷雾条件为：±5 kV喷雾电压，10 μL min^-1流速，100 PSI N₂压力。在最优条件下，使用二元混合物建立了校准曲线，三亚油酸甘油酯在正离子模式下的检测限为0.62 μM，油酸在负离子模式下的检测限为0.84 μM。

总结与讨论

总之，研究人员开发并优化了一种填充硅胶吸附剂的SPE柱，与同轴cESI源结合，构建了一套微型化分离系统，用于在ESI-MS分析过程中实时分馏脂质混合物。同轴喷雾系统和乙酸铵的使用使得非极性有机溶剂也能产生稳定的电喷雾信号。乙酸铵中脂肪酶的存在，通过水解反应提供了额外的结构信息，增强了单次质量分析中的物种鉴定能力。对于二元体系，分馏过程展现了高选择性。对于复杂混合物，通过使用三种不同溶剂进行顺序分馏，实现了93%的检测效率，而直接进样（不使用SPE柱）的检测效率仅为85.7%。通过仔细优化溶剂极性和pH值，改变了不同脂质的溶解度和分析物特性，从而实现了选择性洗脱和吸附。非极性脂质（三亚油酸甘油酯）从硅胶吸附剂上洗脱的检测限为0.62 μM，灵敏度高于极性脂质（油酸）。尽管在复杂混合物分析中实现100%的洗脱选择性具有挑战性，但SPE柱的使用有效降低了基质效应，提高了灵敏度。研究人员认为，经过充分优化，该方法可作为一项快速、稳健的分析技术，在资源有限条件下实现对复杂混合物的直接分析，尤其适用于与便携式质谱仪的结合。