基于 IVIS 的 mRNA-LNP 蛋白表达评估：给药参数及既往 LNP 暴露的影响

《International Journal of Pharmaceutics》：IVIS assessment of mRNA-LNP protein expression: effects of dosing parameters and prior LNP exposure

　　

摘要

利用活体成像系统（IVIS）进行生物发光成像已被广泛用于评估信使RNA（mRNA）脂质纳米颗粒（LNPs）给药后报告蛋白的表达。然而，方法学差异和先前的LNP暴露可能会使结果解释变得复杂。在本研究中，我们评估了在BALB/c小鼠中通过肌肉注射给予封装在SM-102或ALC-0315脂质纳米颗粒中的荧光素酶mRNA后影响IVIS读数的选定参数。我们还研究了重复给药的效应。D-荧光素递送途径、成像间隔和小鼠体位均影响信号采集，而mRNA剂量和注射体积则影响表达的强度和区域分布。接收PBS的小鼠的背景生物发光信号与mRNA-LNP相关信号相比可以忽略不计，这表明在一致的成像条件下确立基线信号后，可能需要专门的阴性对照组。重复给予SM-102或ALC-0315 LNPs均减少了后续mRNA-LNP剂量后的表达。此现象在先前给予含有荧光素酶mRNA或非编码多聚腺苷酸的LNPs后均会发生，而重复PBS注射则无类似效应。因此，表达降低与先前暴露于LNP载体有关，而非与重复注射或编码报告因子的表达有关。这些结果强调了标准化IVIS采集和给药参数（包括mRNA剂量、注射体积和给药方案）的必要性，并证明先前LNP暴露可降低后续mRNA介导的蛋白表达。

引言

mRNA治疗和疫苗的迅速扩展显著增加了在给药后评估mRNA生物分布和蛋白表达的可靠临床前工具的需求。利用活体成像系统（IVIS）进行生物发光成像已被广泛用于评估功能性mRNA递送和蛋白表达，特别是在使用脂质纳米颗粒（LNPs）递送编码荧光素酶mRNA的情况下。D-荧光素给药后，IVIS能够对同一动物进行非侵入性的纵向荧光素酶活性测量，为随时间比较制剂、给药策略和表达动力学提供了一种实用方法。

在同一动物中进行纵向成像的能力可以支持3Rs原则中的减量原则，通过减少每个时间点单独动物队列和终末组织采集的需求（Tao等，2010，Di等，2022）。然而，生物发光信号是功能性mRNA递送的间接测量指标，并受生物学、操作和光学因素的影响。因此，稳健且可重复的IVIS方法学不仅在科学上重要，而且对于支持合乎伦理且高效的临床前研究实践也至关重要。

越来越多的研究使用IVIS来表征mRNA-LNP系统的体内性能。生物发光成像已被应用于比较LNP组成和理化性质、研究给药途径和粒径的影响、监测蛋白表达的强度和持续时间，以及评估注射部位和远端器官的表达。例如，Di等（2022）证明LNP粒径和给药途径均影响LNP生物分布和荧光素酶表达，肌肉注射的LNPs能够进入全身循环并蓄积在肝脏和脾脏中。重要的是，LNP暴露并没有按比例转化为蛋白表达，突出了纳米颗粒生物分布与功能性mRNA表达之间的区别。LNP理化性质（包括粒径）也被证明影响mRNA-LNP疫苗的免疫原性（Hassett等，2021），而其他研究则结合全动物IVIS和离体器官测量来表征mRNA-LNP递送后的功能性表达（Di等，2022）。

尽管广泛应用，研究之间存在相当大的方法学差异。例如，Di等（2022）在荧光素给药后3分钟进行生物发光成像，而Fernandes等（2025）在腹腔注射D-荧光素后10分钟成像；其他mRNA-LNP研究也类似地使用了不同的底物剂量、成像间隔、mRNA剂量、给药途径和感兴趣区域分析方法（Fernandes等，2025）。已发表的研究在量化表达时是使用全动物信号、单个解剖区域还是离体器官也存在差异。这些差异很重要，因为检测到的生物发光信号不仅反映给药mRNA的递送和翻译，还受底物可用性、组织深度和光衰减的影响。因此，方法学差异可能影响测量信号的强度和表观解剖分布，从而可能使研究之间的直接比较变得复杂。尽管个别研究考察了mRNA-LNP生物分布和表达的特定方面，但在其他受控制剂和成像条件下系统评估影响IVIS测量的实验变量的研究仍然有限。

在单个基于IVIS的mRNA研究中，有几项实验考虑因素需要仔细控制，包括mRNA给药途径、剂量和体积；D-荧光素给药途径和时机；动物体位；成像采集设置；以及信号量化。荧光素给药途径和成像时机的差异可以显著影响信号强度和检测信号的表观分布（Inoue等，2009，Khalil等，2013）。同样，mRNA给药后选定的时间点也会显著影响表达的表观强度和分布（Pardi等，2015）。动物体位也可能因组织深度和光衰减的差异而影响检测到的信号。虽然一致的条件使研究内的可靠比较成为可能，但方法学差异和不完整的报告可能会限制可重复性和跨研究比较。此外，mRNA剂量会影响表达强度，注射体积和注射位点数量也是值得考虑的实验变量。因此，在解释基于IVIS的mRNA-LNP研究时，这些参数应与制剂特征一并定义和报告。

给药史是另一个对mRNA-LNP介导的蛋白表达影响较小但研究较少的决定因素。重复暴露于LNPs可能诱导载体相关的生物学反应，从而改变随后给予的制剂的活性。推测的机制包括对LNP成分的免疫识别、对PEG-脂质的反应以及重复给药后纳米颗粒分布的变化（Lee等，2024，Hassanel等，2025，Tenchov等，2023，Jo等，2025，Besin等，2019）。随着mRNA-LNP技术从单剂量应用扩展到需要重复给药的疗法方案，这些效应尤其相关。

在本研究中，我们首先检查了已发表的基于IVIS的mRNA研究，以表征实验设计差异和方法学报告完整性。然后评估了肌肉注射封装在SM-102或ALC-0315 LNPs中的荧光素酶mRNA后影响IVIS读数的选定参数，包括D-荧光素给药途径、底物后成像间隔、动物体位、背景信号、mRNA剂量、注射体积和注射位点数量。最后，进行了重复给药研究，以确定连续给药后表达降低是否与重复注射、先前给予的载荷或先前暴露于LNP载体有关。因此，本研究旨在确定最影响基于IVIS的mRNA表达测量的实验变量，确定优先标准化的变量，并评估先前给药史如何影响后续mRNA-LNP介导的蛋白表达。

各章节摘要

材料

SM-102（庚烷-9-基 8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯）和ALC-0315（[(4-羟丁基)氨基二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)）购自BroadPharm（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。DSPC（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）购自Lipoid（德国路德维希港）。DMG-PEG 2000（1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000）和ALC-0159（甲氧基聚乙二醇醚氧基(2000)-N,N-双十八烷酰胺）购自

已发表基于IVIS的mRNA研究中的实验设计和报告差异

对已发表的基于IVIS的mRNA研究进行了一次有针对性的、非系统的调查，以说明当前的实验实践和报告完整性。考虑的主要变量包括mRNA给药途径、剂量浓度和体积；D-荧光素给药途径和时机；以及成像期间动物体位（图1A）。在考察期间，使用IVIS评估mRNA介导表达的研究数量显著增加，增长幅度最大的是

讨论

本研究解决了临床前mRNA研究中一个实际但被忽视的问题：IVIS来源的表达数据对实验设计选择高度敏感，而这些选择往往报告不完整。图1中的分析表明，mRNA研究中IVIS的使用正在增加，但荧光素给药、剂量选择、成像位置和报告完整性仍存在相当大的变异性。这并不一定要求采用单一通用方案，但确实

结论

可靠比较基于IVIS的mRNA-LNP表达需要一致的成像条件，并考虑给药剂量和先前LNP暴露。D-荧光素给药、成像间隔和动物体位应在研究内标准化，而mRNA剂量、浓度、注射体积和给药方案应明确报告。在所评估条件下观察到的低背景信号也支持对阴性对照的适当使用

CRediT作者贡献声明

Rebecca Macfarlane：写作—审阅与编辑、写作—原稿撰写、方法学、调查、正式分析、概念化。Burcu Binici：写作—审阅与编辑、方法学、调查、正式分析。Muattaz Hussain：写作—审阅与编辑、方法学、调查、正式分析。Ankita Borah：写作—审阅与编辑、方法学、调查、正式分析。Lee Wheeler：写作—审阅与编辑、方法学、调查、正式分析。Michael

资金支持

本项目由Cytiva和斯特拉斯克莱德大学纳米医学中心博士生培训计划支持。

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作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Natalie Orr和Samuel Clarke是Cytiva的员工。其余作者声明他们没有任何已知的相互竞争的财务利益或个人关系可能影响本文所报道的工作。

Rebecca Macfarlane|Burcu Binici|Muattaz Hussain|Ankita Borah|Lee Wheeler|Michael Wilkinson|Natalie Orr|Samuel Clarke|Yvonne Perrie