《Advanced Healthcare Materials》：Topically Delivered Treg-Attracting Microparticle-Hydrogel Composites Recruit Regulatory T Cells and Limit Cardiac Injury After Severe Ischemia
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缺血性心脏病是世界范围内高度流行且致残的疾病。缺血性损伤后，免疫反应可能过度活化，并将损伤扩散至邻近的健康组织。由于心脏缺乏再生能力，防止过度损伤至关重要。现有的免疫抑制疗法对浸润免疫细胞的炎症和修复功能进行无差别抑制。调节性T细胞（Treg）是机体调节免疫活
缺血性心脏病是世界范围内高度流行且致残的疾病。缺血性损伤后，免疫反应可能过度活化，并将损伤扩散至邻近的健康组织。由于心脏缺乏再生能力，防止过度损伤至关重要。现有的免疫抑制疗法对浸润免疫细胞的炎症和修复功能进行无差别抑制。调节性T细胞（Treg）是机体调节免疫活性的高度精密系统，这些细胞能够提供强大的免疫抑制，同时通过直接刺激局部细胞来放大修复通路。研究人员的研究团队此前开发了一种由聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）可降解微球（MP）组成的聚合物递送系统，负载Treg趋化蛋白CCL22。在前期研究中，研究人员证明了CCL22MP能吸引Treg至注射部位并抑制不利炎症。在此，研究人员将Treg吸引性MP技术与水凝胶结合以增强或吸引调节性T细胞（HEART）。局部应用HEART在永久结扎心肌梗死（MI）后显著减小梗死面积并改善射血分数，且在心脏移植缺血模型中将移植物纤维化减少，同时在第30天使移植物内Foxp3+ Treg显著增加。疗效与损伤严重程度相关，表明严重缺血性损伤是该治疗策略可能最具获益潜力的场景。
论文解读：
**研究背景与现存问题**
缺血性心脏病是全球范围内高发且致残率极高的疾病，每年约导致900万人死亡，全球约2.5亿人罹患此病。心肌梗死（MI）是缺血性心脏病的关键触发事件，早期组织损伤和随后的病理性组织重塑导致心血管疾病快速进展。尽管经皮冠状动脉介入治疗（PCI）和溶栓治疗能够恢复血流，但再灌注本身会造成额外损伤即再灌注损伤（RI），其可能占最终梗死面积的一半。目前尚无FDA批准的药物能够预防或减轻RI。心脏缺乏再生功能性心肌细胞（CMs）的能力，因此任何损伤都是永久性的。缺血损伤后，坏死CMs释放损伤相关分子模式（DAMPs），引发过度活跃的免疫反应，免疫细胞被无差别激活后通过NETosis、氧化活性物质、颗粒酶等效应机制损伤邻近健康心肌组织，即梗死扩散。炎症常无法充分消退，导致组织修复不良和心力衰竭进展。
调节性T细胞（Treg）是机体精细调控免疫活性的系统，能提供强效免疫抑制并放大修复通路。已有研究表明Treg在梗死心脏中具有关键的保护作用。然而，既往Treg相关治疗策略多为全身性给药或基因改造手段，缺乏心脏局部特异性，且未有直接将Treg招募至心脏的治疗方法报道。因此，开发一种能够在心脏局部持续招募Treg、抑制梗死扩散并促进修复的递送策略，具有重要的临床转化价值。
**研究目的与开展的工作**
研究人员此前开发了负载CCL22的PLGA可降解微球（CCL22MP），能够持续释放Treg趋化因子CCL22，在多种炎症疾病模型中有效增加局部Treg数量并减轻疾病严重程度。然而，将CCL22MP直接注射至心脏难以实现有效滞留。为实现心脏局部递送，研究人员将CCL22MP悬浮于多种水凝胶中，开发了一系列“增强或吸引调节性T细胞的水凝胶”（HEART）复合制剂，通过水凝胶的组织适应性、可注射性和组织粘附性实现微球在心肌的锚定和缓释。研究系统评估了三种不同类型的水凝胶平台：热响应性温敏水凝胶、可注射的透明质酸基水凝胶，以及四种组织粘附性水凝胶（光交联HEMA-透明质酸凝胶和FDA批准的Coseal、Artiss、Tisseel密封胶），筛选出最适合体内应用的材料。随后，研究人员采用三种不同严重程度的小鼠心脏缺血损伤模型——短暂缺血再灌注（RI）MI模型（局部损伤有限）、永久结扎慢性缺血MI模型（显著局部损伤）和心脏移植缺血模型（显著整体损伤）——全面评估HEART的治疗效果。
**主要关键技术方法**
研究人员采用了多种关键技术方法。微球制备采用双乳液溶剂蒸发法（w/o/w），将CCL22蛋白封装于PLGA/PEG-PLGA聚合物中。水凝胶配方涵盖热响应性聚N-异丙基丙烯酰胺温敏凝胶、功能化透明质酸（HA-AD/HA-CD）剪切变稀可注射凝胶、HEMA-透明质酸光交联凝胶，以及FDA批准的纤维蛋白胶Tisseel、Artiss和PEG基密封胶Coseal。体外释放实验通过ELISA定量CCL22累积释放曲线。体内研究包括Langendorff离体心脏灌注评估生物相容性、活体荧光成像（IVIS）定量微球心肌滞留。心肌梗死模型采用左前降支（LAD）动脉永久或短暂（30分钟）结扎。心脏移植缺血模型采用同系C57BL/6J小鼠供心经4小时缺血后异位移植。组织学评估使用Masson三色染色定量纤维化面积，免疫组化检测Foxp3
+细胞，流式细胞术分析移植物内免疫细胞亚群和活化状态。研究使用雄性C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠（各模型具体周龄见原文），所有动物实验经匹兹堡大学IACUC批准。
**研究结果**
**3.1 温敏水凝胶局部递送CCL22MP减轻心肌梗死损伤（初步研究）**
在永久结扎MI模型中，研究人员将CCL22MP或空白MP悬浮于热响应性水凝胶中，局部涂抹至梗死心脏表面。结果显示，与空白MP组相比，CCL22MP组平均梗死面积显著减少约10%，且在第7天和第28天射血分数显著改善，收缩末期容积（第7天和第28天）和舒张末期容积（第28天）均显著降低。这提示CCL22MP治疗能够通过减少组织损伤来改善心脏功能。
**3.2 可注射HEART（iHEART）的临床转化配方**
研究人员将CCL22MP悬浮于透明质酸基水凝胶中制成可注射HEART（iHEART），观察到CCL22释放曲线呈现降低但更线性化的特征。冻干后iHEART可在3小时内完全复水。通过包载AlexaFluor680标记的葡聚糖微球（AF680MP）评估注射变异性，发现20 mg/mL低剂量配方比100 mg/mL高剂量配方具有更好的注射重现性，高剂量配方在针头和注射器筒中损失约70%–80%的微球。选择20 mg/mL浓度进行Langendorff离体心脏实验，证实iHEART注射对心脏收缩性、松弛性和做功能力无显著影响。
**3.3 iHEART在缺血再灌注MI模型中的微球滞留与功能评价**
将AF680MP悬浮于iHEART中注入健康大鼠心肌（n=4–6/组），14天后荧光定量显示水凝胶组微球滞留显著高于生理盐水组。随后在临床相关的缺血再灌注（RI）MI模型（LAD结扎30分钟后松开）中，空白MP和CCL22MP的iHEART组心功能与健康对照相当，但两组间无统计学差异，iHEART治疗组与未治疗MI对照组之间的差异也未达到统计学显著性。
**3.4 局部粘附水凝胶的筛选与优化**
研究人员比较了UV交联HEMA-透明质酸凝胶、Coseal、Artiss和Tisseel四种组织粘附水凝胶。各水凝胶均能在5分钟内交联、包载微球并形成均匀悬浮。降解动力学显示：UV凝胶持续>32天，Tisseel约25天开始降解，Artiss约15天后降解，Coseal约6天后降解且伴显著溶胀。CCL22释放方面，Coseal释放曲线与游离CCL22MP最为接近，其余水凝胶轻微抑制CCL22释放。离体心脏组织粘附实验中，Artiss和Tisseel显示较高的荧光信号即较好的微球滞留，但仅Tisseel的荧光差异达到统计学显著（p<0.05）。基于降解时间、释放特征和滞留效果的综合评价，研究人员选择Tisseel作为体内应用的最佳候选凝胶。
**3.5 CCL22MP/Tisseel减少同系移植缺血损伤并增加局部Treg**
在同系心脏移植缺血模型中（供心缺血4小时后移植，术后即刻在心脏表面局部涂抹Tisseel+MP），术后30天组织学分析显示：CCL22MP/Tisseel处理组供心纤维化面积较未治疗组和空白MP对照组显著减少；Foxp3免疫组化显示CCL22MP组Foxp3
+ Treg密度显著增高（n=5–6/组，p<0.05–0.01）。然而，术后第5天流式分析未发现CCL22MP组与空白MP组在Treg、巨噬细胞、T细胞或B细胞的频率或数量上有显著差异，也未检测到促炎（CD86、iNOS）或修复（ST2、CD301b、Arg1）标志物表达的早期改变。这一时间模式与CCL22MP的持续释放动力学一致，即局部趋化因子梯度在数周内逐渐累积而非术后数天内急性发挥作用。
**讨论总结与结论**
该研究系统评估了多种HEART制剂在不同严重程度心脏缺血损伤模型中的治疗效果，发现CCL22MP治疗在造成显著心脏损伤的模型（永久结扎MI和心脏移植缺血）中能够显著减轻心脏损伤，而在短暂的缺血再灌注MI模型中未观察到统计学显著的改善。这一结果提示Treg趋化治疗在严重心脏缺血事件后可能具有最大获益潜力。
讨论部分指出，Treg在心肌梗死后具有多种保护作用，包括诱导巨噬细胞向M2修复表型极化、增强胶原分泌改善瘢痕形成、减少炎症细胞浸润和心肌凋亡、降低有害基质金属蛋白酶浓度等。CCL22MP在多个炎症疾病模型中的疗效已得到验证，而本研究所开发的HEART平台有效解决了微球在心肌中滞留差的问题。值得关注的是，水凝胶对CCL22释放的抑制可能归因于交联网络形成的额外物理扩散屏障，而非化学相互作用。在移植缺血模型中，移植物纤维化的减少与Foxp3
+ Treg的显著富集呈正相关，支持Treg招募作为延长移植物存活的有前景的治疗策略。研究者指出，未来需利用Foxp3-DTR转基因小鼠进行遗传性Treg耗竭实验以确认Treg的必要性，并通过CCR4敲除模型阐明CCL22对其他CCR4表达细胞群的作用机制。
**结论**
综合所有数据，通过局部递送CCL22MP招募Treg是一种有效的心脏缺血损伤保护策略，尤其在严重损伤模型中效果显著。研究人员开发的HEART平台结合了微球的持续缓释特性和水凝胶的组织粘附与保留能力，为心脏局部免疫调控提供了可行的递送方案，有望减少严重心脏缺血事件后的组织损伤和心力衰竭进展。
