基于Ecobody技术从非免疫化兔单B细胞中鉴定和表征一种针对肠道细菌的高亲和力抗原结合片段

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Identification and characterization of a high-affinity antigen-binding fragment against intestinal bacteria from non-immunized rabbit single B cells using Ecobody technology

　　

抗体在介导宿主与微生物组之间的相互作用中发挥重要作用。尽管它们非常重要，但针对肠道微生物组的天然抗体的特异性和功能特性仍然知之甚少，尤其是在单克隆水平上。在此，我们采用了Ecobody技术（一种基于单个B细胞的抗体筛选平台），从未经免疫的兔子中鉴定肠道细菌反应性抗原结合片段（Fabs）。以纤维素分解拟杆菌（Bacteroides cellulosilyticus）为模型抗原，我们利用无细胞蛋白合成（CFPS）技术鉴定并表达了Fabs，随后在好望角短杆菌（Brevibacillus choshinensis）中生产了一种选定的Fab，以进行详细的活性表征。纯化的Fab对各种肠道细菌表现出广泛的反应性，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。相反，它不与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或HEK293T细胞结合，表明其对细菌相关抗原具有特异性。值得注意的是，所选Fab对纤维素分解拟杆菌表现出高亲和力（K_D = 2.41 nM）。这些结果提供了单克隆水平的证据，表明针对肠道细菌的抗体存在于未经免疫宿主的周围B细胞库中。此外，本研究证明将Ecobody技术与好望角短杆菌表达系统相结合，提供了一种可行的策略，以促进对宿主抗体-微生物组相互作用的进一步研究。

章节片段

从未经免疫的兔子中分离和鉴定肠道细菌

从一只13周龄未经免疫的兔子（新西兰白兔）中收集的盲肠内容物（8.4 mg）悬浮于1 mL磷酸缓冲盐水（PBS）中，接种于GAM琼脂培养基（日本日水，东京）上，并在37 °C厌氧条件下培养48小时。利用正向通用引物7F（5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′）和反向通用引物1510R，对所得菌落全长（约1.5 kbp）16S rDNA基因进行菌落PCR扩增。

将兔子肠道细菌分离和鉴定为模型抗原

从兔子盲肠内容物中获得的两个细菌分离株基于16S rDNA测序被成功鉴定为纤维素分解拟杆菌（B. cellulosilyticus）和远端普雷沃氏菌（P. distasonis）（图S3A和B）。对兔子盲肠内容物进行直接16S rDNA测序进一步证实了肠道微生物组中存在拟杆菌属（Bacteroides）和普雷沃氏菌属（Parabacteroides）物种（图S4）。然而，远端普雷沃氏菌在新鲜平板上分培养时未能生长，使其不适合下游抗原制备。因此，B.

讨论

在本研究中，我们使用Ecobody技术结合好望角短杆菌表达系统，从未经免疫兔子的周围B细胞中鉴定并表征了一种肠道细菌结合Fab。所鉴定的Fab源自IgM型抗体，并对多种肠道细菌表现出反应性，表明微生物组反应性抗体存在于天然抗体库中。这一发现与几份报告一致。

CRediT作者贡献声明

Khairil Anwar：撰写 – 初稿，可视化，方法学，调查，数据整理。Shota Kaneko：方法学，调查。Itsuki Kawakita：验证，方法学，调查。Daffa Sean Adinegoro：调查。Monami Kihara：方法学，调查。Takaaki Kojima：指导，方法学，调查。Teruyo Ojima-Kato：撰写 – 审阅与编辑，指导，方法学。Hideo Nakano：撰写 – 审阅与编辑，指导，项目管理，经费获取。

写作过程中生成式AI及AI辅助技术的声明

在准备本工作期间，作者使用ChatGPT以提高稿件的语言质量和可读性。使用该工具后，作者仔细审阅并编辑了内容（如必要），并对出版物的内容承担全部责任。

致谢

本研究部分资金由日本科学技术振兴机构（JSPS）的科学研究报告资助（编号：22520782和19105921）以及大阪发酵研究所（IFO）的研究资助G-2022-3-021提供支持。Khairil Anwar获得日本文部科学省（MEXT）奖学金和名古屋大学变革性化学-生物学研究研究生课程（GTR）的资助。Daffa Sean Adinegoro。

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