《Journal of Bone Oncology》：Ultrastructural pathological features and clinical significance of recurrent chordoma
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复发性脊索瘤（recurrent chordoma）与原发性病灶相比，表现出独特的进行性超微结构病理重塑。线粒体相关内质网膜复合物（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane, MAM）的破坏与
复发性脊索瘤（recurrent chordoma）与原发性病灶相比，表现出独特的进行性超微结构病理重塑。线粒体相关内质网膜复合物（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane, MAM）的破坏与侵袭性伪足（invadopodia）的激活是脊索瘤复发的核心亚细胞标志。超微结构损伤的严重程度与既往脊索瘤复发次数呈正相关。超微结构检查对脊索瘤复发风险预测和恶性分层具有辅助价值。脊索瘤是一种起源于胚胎残余脊索组织的罕见原发性骨肿瘤，主要累及颅底、骶尾部及中轴脊柱，占所有原发性骨肿瘤的1%至4%。尽管其生长缓慢，但具有强局部侵袭性和持续较高的术后复发率，仍是主要临床挑战。临床随访数据显示，单纯手术切除患者的5年复发率可达60%至80%。反复复发的脊索瘤常发生去分化、恶性升级甚至远处转移，是导致远期预后不良和总生存期缩短的主要原因。目前脊索瘤的常规临床诊断主要依赖光学显微镜组织病理学和免疫组织化学标志物。经典原发性脊索瘤在光学显微镜下通常呈现空泡化液滴状细胞（physaliferous cells）和黏液样间质，诊断体系已较完善。然而，目前认识到部分看似常规低级别脊索瘤在术后反复复发，且部分发生组织学进展为去分化或低分化表型，其转移率和生存期显著恶化。常规光学显微镜仅能识别组织水平的形态差异，无法捕捉亚细胞水平的细微病理改变，难以阐明脊索瘤术后复发、侵袭和进展的形态学机制。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）可直接观察细胞器构型、细胞间连接模式和功能性亚细胞复合物，在光学显微镜和免疫组织化学无法确诊时仍是诊断外科病理学的有用辅助工具。既往大多数脊索瘤超微结构研究聚焦于原发性肿瘤，据研究人员所知，尚未有系统性的原发与复发灶TEM比较报道。复发性脊索瘤特有的亚细胞病理指标尚未明确，复发的超微结构调控机制仍有待阐明。在此背景下，本研究系统比较了原发与复发脊索瘤的超微结构差异，总结了复发性脊索瘤的特异性亚细胞病理特征，并探讨了超微结构异常与肿瘤复发、侵袭和恶性转化之间的关联。研究结果可能揭示脊索瘤复发在亚细胞水平的核心病理机制，并为复发风险早期预测、恶性分级标准优化和治疗靶点筛选提供形态学证据。
一、研究背景与问题
脊索瘤（chordoma）是一种罕见的原发性骨肿瘤，起源于胚胎残留脊索组织，主要累及颅底、骶尾部和脊柱中线，约占所有原发性骨肿瘤的1%至4%。尽管生长缓慢，脊索瘤具有强局部侵袭性和持续较高的术后复发率，单纯手术切除后5年复发率可达60%至80%。反复复发的脊索瘤常发生去分化、恶性升级甚至远处转移，是导致远期预后不良和总生存期缩短的主要原因。目前常规临床诊断依赖光学显微镜组织病理学和免疫组织化学标志物，经典原发性脊索瘤的诊断体系已较完善。然而，部分看似低级别的脊索瘤术后反复复发，部分发生组织学进展为去分化或低分化表型，转移率和生存期显著恶化。常规光学显微镜仅能识别组织水平的形态差异，无法捕捉亚细胞水平的细微病理改变，难以阐明术后复发、侵袭和进展的形态学机制。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）可直接观察细胞器构型、细胞间连接模式和功能性亚细胞复合物，是光学显微镜和免疫组织化学无法确诊时的有用辅助工具。既往脊索瘤超微结构研究多聚焦于原发性肿瘤，尚无系统性原发与复发灶TEM比较报道，复发性脊索瘤特有的亚细胞病理指标尚未明确。因此，研究人员开展本研究，系统比较原发与复发脊索瘤的超微结构差异，总结复发性脊索瘤的特异性亚细胞病理特征，探讨超微结构异常与肿瘤复发、侵袭和恶性转化之间的关联。
二、研究设计与技术方法
研究人员收集2020年1月至2025年5月间100例手术切除脊索瘤标本，包括50例复发脊索瘤（复发组）和50例原发脊索瘤（原发组），标本来自首都医科大学附属北京天坛医院神经病理科。复发组中37例为单次复发，13例为两次及以上复发；16对为同一患者匹配的原发-复发配对标本。所有标本在切除后30分钟内取样，经3%戊二醛固定、1%锇酸后固定、梯度乙醇和丙酮脱水、Epon 812环氧树脂包埋，制备70 nm超薄切片，铀酰乙酸和柠檬酸铅双重染色。使用日立H-7650透射电子显微镜观察，每例随机选取5个避开坏死、出血、纤维化和炎症区域的高倍视野，由两名对分组设盲的神经病理学家独立评估，Cohen's kappa为0.79，分歧由第三名资深病理学家协商解决。主要观察指标包括肿瘤细胞整体形态、胞质空泡结构、线粒体和粗面内质网形态、线粒体相关内质网膜复合物（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane, MAM）完整性、核形态和染色质分布、细胞间桥粒连接、细胞膜突起以及间质和微血管超微结构。统计学分析使用GraphPad Prism 8软件，分类数据以n(%)表示，组间比较采用卡方检验或Fisher精确检验，正态分布连续数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、研究结果
3.1 原发性脊索瘤的超微结构特征
原发组脊索瘤细胞形态规则，多为卵圆形或多边形，排列疏松有序。细胞核形态规则，核膜光滑连续，染色质分布均匀。胞质内含丰富、大小均匀、边界清晰的滴状空泡，对应脊索瘤典型的液滴状细胞形态。线粒体完整，嵴清晰连续；粗面内质网排列规则，无扩张、囊泡化或核糖体脱失。MAM复合物结构完整、分布有序。细胞间桥粒连接丰富且结构完整。细胞膜表面有细长规则的微绒毛，无侵袭性伪足。肿瘤间质富含均质无定形黏液样基质，血管形态规则完整，无畸形或异常通透性。
3.2 复发性脊索瘤的超微结构改变
复发组脊索瘤细胞表现出广泛的病理重塑和异型性，与原发组差异显著。非配对比较中，复发组各超微结构异常检出率均显著高于原发组：非典型胞质空泡94.0%对23.5%，线粒体肿胀和嵴断裂97.1%对20.6%，粗面内质网扩张/脱颗粒94.0%对11.7%，MAM复合物崩解97.1%对8.8%，核异型性改变97.1%对26.5%，桥粒连接减少/缺失94.0%对32.3%，间质和微血管结构异常91.2%对8.8%，所有指标P<0.001。配对比较显示复发灶较同一患者原发灶呈现一致且显著的超微结构恶化。
3.3 胞质空泡发育异常
复发组整体空泡化程度显著增加，空泡大小高度不一、形态不规则，大量空泡融合形成边界模糊的巨囊腔。内部基质紊乱降解、稀疏空泡化，原发脊索瘤特征性的均一滴状空泡结构完全破坏。部分肿瘤细胞空泡完全崩解，胞质呈网状疏松变性。复发组非典型胞质空泡检出率为96.0%（48/50），显著高于原发组的16.0%（8/50）（P<0.001）。两次及以上复发者空泡崩解和胞质疏松变性更为突出。
3.4 细胞器损伤与MAM复合物崩解
复发组肿瘤细胞线粒体普遍肿胀变形，嵴断裂溶解，部分呈空泡变性。粗面内质网显著扩张囊泡化，广泛核糖体脱失，扩张池内含有大量紊乱絮状沉积物。胞质内检测到大量自噬体包括线粒体自噬体，糖原聚集形成糖原湖，高尔基体数量增加，大量微丝和脂滴沉积。特征性的MAM复合物大部分崩解、结构松散、排列紊乱，仅6%（3/50）复发灶保留完整复合物，显著低于原发组的96%（48/50）（P<0.01）。胞质内游离核糖体显著增加，提示增殖和代谢活性异常升高。
3.5 显著核异型性
复发组肿瘤细胞核高度不规则，核膜多处深折叠、内陷和切迹，部分区域连续性中断。核仁肥大、数量增加并向核膜边缘移位。染色质高度凝聚、成块聚集、分布不均。频繁观察到双核肿瘤细胞和凋亡细胞，核大小变异显著，增殖极性完全紊乱。核异型性与复发次数正相关，两次及以上复发者检出率达100%（13/13），病理损伤较单次复发者更严重。
3.6 细胞间连接降解与侵袭结构激活
复发组细胞间桥粒连接显著减少且结构受损，部分区域完全缺失，导致肿瘤细胞离散度增加。细胞膜表面原有细长微绒毛大部分脱落，被大量钝圆、不规则的侵袭性伪足（invadopodia）取代。迁移和侵袭相关结构的持续激活表明肿瘤细胞运动性和侵袭性显著增强。
3.7 间质微结构破坏与微血管畸形
复发组黏液样间质基质广泛降解缺失，整体间质结构疏松紊乱，纤维束排列紊乱、断裂纤维化和胶原散在。间质微血管壁变薄，内皮细胞间紧密连接断裂或缺失，管腔内可见淋巴细胞浸润。内皮细胞核固缩，细胞膜崩解。血管基底膜均匀变薄，与内皮细胞和周细胞连接松散并向外延伸脱离血管壁。部分血管周围细胞染色质丢失，血管腔内可见溶酶体。肿瘤血管通透性异常增加，部分微血管基底膜缺损断裂，为局部浸润和潜在远处转移构建了有利微环境。
3.8 超微结构异常发生率比较
配对和非配对比较均验证复发脊索瘤组织相对其匹配或非匹配原发肿瘤呈现一致且显著的超微结构恶化。复发频率与亚细胞器损伤严重程度之间观察到正相关，多次复发者超微结构破坏更为显著。复发组所有评估的超微结构病理病变检出率均显著高于原发组，所有指标差异均有统计学意义（P<0.05）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，复发性脊索瘤表现出区别于原发肿瘤的特异性进行性亚细胞病理损伤，持续的亚细胞结构病理重塑是术后反复复发、局部侵袭和组织学进展的形态学基础。病理超微结构改变主要涉及四个核心维度：细胞器功能障碍、细胞极性丧失、侵袭结构激活和肿瘤微环境失衡。胞质空泡化是脊索瘤最显著的特征，原发肿瘤中稳定参与细胞代谢和渗透稳态；复发肿瘤中空泡更大、更不规则并融合为巨囊腔，均一滴状构型丧失。线粒体和粗面内质网维持能量供应、蛋白质合成和凋亡调控，MAM接触协调Ca2+信号、脂质代谢和细胞死亡决策；复发肿瘤中观察到广泛线粒体肿胀和嵴溶解、粗面内质网脱颗粒及MAM接触崩解。核多形性增加、核仁突出和核分裂活性升高与脊索瘤较高增殖分数和侵袭行为相关，分子层面从常规向复发或去分化脊索瘤的进展伴随TP53改变和其他基因组变化及表观遗传重塑。细胞间粘附结构丧失是肿瘤细胞播散的标志，桥粒连接减少和膜突起与运动性增加相容；侵袭性伪足型突起是癌细胞特异性结构，可在体外和实验模型中局灶降解细胞外基质。间质基质降解和微血管畸形不仅为肿瘤增殖提供充足营养，还破坏局部组织屏障促进侵袭和转移。更多复发次数与更严重的亚细胞恶性损伤相关，支持脊索瘤"手术复发-亚细胞恶性转化-侵袭性增强-进一步复发"的恶性循环。
超微结构检查可弥补常规病理检测的不足，具有临床转化价值。研究团队提出可检验假设：若前瞻性队列证实早期亚细胞病变（如MAM初期破坏、空泡异型和连接退化）先于复发出现，携带这些特征的患者可考虑加强随访，但这仍属推测，需前瞻性验证。超微结构异常严重程度随既往复发次数增加而增加，使这些特征成为进行性组织学改变的候选描述性标志物，但尚不提议作为新的亚细胞分级系统，治疗决策应继续遵循现行指南和多学科评估。核心病理特征包括MAM解构、细胞连接丢失和间质微血管异常，揭示了恶性进展的关键结构靶点，针对亚细胞结构修复、细胞粘附重建和肿瘤微环境稳态的靶向策略可能有效抑制增殖和侵袭并打破复发循环。
研究局限性包括：配对原发-复发标本稀缺，相当比例肿瘤无对应样本，采用非配对比较补充可能引入残余混杂；透射电子显微镜仅检测极小部分肿瘤体积，亚细胞损伤半定量分级依赖观察者；回顾性单中心设计无独立验证集限制普适性；研究为描述性，未检测超微结构紊乱是否先于侵袭行为或反映其后果。建议未来开展前瞻性验证，多中心队列采用标准化组织处理、盲法重复评分和评估观察者间一致性，以时间-事件建模校正已确立的临床病理协变量，推导并外部验证复发性脊索瘤专用超微结构风险评分；同时整合相关光-电镜与基因组和蛋白质组学分析，阐明产生这些亚细胞异常的调控回路。
研究结论：脊索瘤复发伴随亚细胞结构的逐步重组，复发标本中发现非典型胞质空泡化、弥漫性细胞器损伤、MAM复合物碎裂、核异型性、细胞间连接复合物丢失和间质微血管畸形。这些异常应视为共同发生的形态学特征，其联合效应可能促进术后复发、局部浸润和恶性进展。在此限度内，透射电子显微镜捕获了常规组织学和免疫组织化学通常遗漏的与复发相关的早期亚细胞紊乱，因此可作为复发性脊索瘤风险分层、分级细化、治疗定制和预后判断的辅助手段。
