《Journal of Biotechnology》：Overcoming the limits of long-range PCR with a Pfu-sso7d polymerase fortified by a TneSSB-dUTPase cocktail
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我们建立了一种成本效益高且性能优异的PCR系统，用于内部使用。
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组合使用TneSSB和
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我们建立了一种成本效益高且性能优异的PCR系统，用于内部使用。
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组合使用TneSSB和dUTPase显著提高了PCR的效率。
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优化后的系统能够快速扩增长达15 kb的DNA片段。
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优化后，长距离PCR的产量提高了约四倍。
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该系统对抑制剂具有很高的耐受性，能够从临床样本中有效扩增DNA。
引言
聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中的基础技术，以其高效性和生成多个DNA拷贝的多样性而闻名，在克隆策略中用于获取基因片段，在测序中用于检测大范围的缺失或替换（Huang等人，2024年；Dubey等人，2016年）。
Thermus aquaticus DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）是最常用的PCR酶，因其热稳定性和高DNA合成活性（Ishino和Ishino，2014年）。然而，Taq DNA聚合酶缺乏3′ → 5′外切核酸酶的校对功能，导致复制保真度相对较低（8.0 × 10?6突变/碱基对/PCR循环）（Cline等人，1996年；Lundberg等人，1991年）。相比之下，Pyrococcus furiosus DNA聚合酶（Pfu DNA聚合酶）具有内在的3′ → 5′外切核酸酶校对功能，其保真度约为Taq DNA聚合酶的八倍（Wong等人，2013年；Goldman等人，1998年；Hogrefe等人，2002年；Nuryana等人，2023年）。然而，Pfu也有一些缺点（Wang等人，2004年）。首先，它的合成速率比Taq低两倍（Cline等人，1996年）。其次，这种酶容易从DNA模板上解离（Stadhouders等人，2010年）。因此，使用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增通常需要更长的延伸时间（大约2分钟/kb）（Cline等人，1996年；Stadhouders等人，2010年），并且一般只能扩增长度不超过5 kb的片段（Wang等人，2004年）。
为了提高PCR反应的进程性，人们开发了几种策略。首先，通过将Pfu与在Sulfolobus solfataricus中发现的一种非特异性双链DNA结合蛋白（sso7d）融合，创建了一种嵌合蛋白，并将其命名为Pfu-sso7d（Guagliardi等人，2002年）。Sso7d是一种碱性小蛋白，可以结合双链DNA的小沟，促进互补DNA链的退火，并诱导负超螺旋形成，从而在高温下保护DNA免于变性与破坏（Guagliardi等人，2002年；Sundarrajan等人，2018年）。这种融合蛋白通过减少Pfu从DNA模板上的解离，并使其在核苷酸添加过程中能够沿模板平滑滑动，从而提高了其进程性（Cline等人，1996年；Wang等人，2004年；Zhai等人，2019年；Sun和Huang，2013年）。这种Pfu-sso7d能够扩增长达15 kb的DNA片段，并且每个kb只需要1分钟的延伸时间（Wang等人，2004年）。其催化活性、热稳定性或保真度均未受到影响（Wang等人，2004年）。
第二，研究表明dUTPase可以通过减少PCR循环过程中由于dCTP脱氨而积累的dUTP来提高PCR效率（Hogrefe等人，2002年；Cho等人，2007年）。将dUTPase加入Pfu反应中可以迅速提高2 kb和5 kb片段的PCR产量，且不会影响MgCl2、KCl和Triton X-100的浓度，尽管它可能会受到其他添加剂（如BSA）的影响（Cho等人，2007年）。将Pfu与dUTPase结合使用可以将扩增能力从1 kb提高至15 kb，但这种方法尚未被广泛采用（Hogrefe等人，2002年）。尽管基于dUTPase的增强技术已被应用于某些商业化的Pfu基聚合酶中，如PfuTurbo和PfuUltra，但它作为单独提供的PCR组分的使用仍然相对有限。此外，虽然dUTPase可以提高PCR效率，但它并不一定能提高扩增的特异性，并且在某些反应条件下可能会导致PCR产物出现模糊现象（Hogrefe等人，2002年；Cho等人，2007年）。
第三，来自Thermotoga neapolitana的单链DNA结合（SSB）蛋白对单链DNA具有高亲和力和序列独立性，可以防止分子内碱基配对和二级结构的形成。TneSSB具有极强的热稳定性，在100°C下的半衰期约为12小时，熔解温度为112.5°C，其单链DNA结合活性基本不受盐浓度的影响（Olszewski等人，2010年；Perales等人，2003年；Karunanathie等人，2022年；Zhang和Tanner，2017年；Jose等人，2015年）。这些特性使得TneSSB成为一种有吸引力的PCR增强剂，特别是在高温循环条件下。通过覆盖暴露的单链DNA，SSB蛋白可以保持模板和引物链的可访问构象，减少抑制性二级结构的形成，并降低聚合酶的暂停，从而促进DNA合成（Perales等人，2003年；Karunanathie等人，2022年；Zhang和Tanner，2017年；Jose等人，2015年）。与这种机制一致，Thermus thermophilus来源的SSB已被证明可以提高Tth和Pfu DNA聚合酶的合成速率，使得可以扩增长达3.2 kb的DNA片段，并且在某些情况下还能提高聚合酶的保真度（Perales等人，2003年）。然而，SSB蛋白能否有效扩增更长的目标片段（特别是超过10 kb的片段）以及在长距离PCR中减少延伸时间的能力尚未得到充分研究。虽然将SSB结构域融合到DNA聚合酶中可以提高扩增产量和合成效率，但这种策略并未始终能够增加PCR产物的最大长度（Olszewski等人，2017年）。
第四，将DNA聚合酶与DMSO和甲酰胺等有机溶剂混合只会增加PCR产量和特异性（Farell和Alexandre，2012年），而甘油、蔗糖、葡萄糖和山梨醇等糖类物质可以在不减少延伸时间的情况下提高产量（Sakhabutdinova等人，2020年）。
这些策略已经单独进行了研究。在这项研究中，我们结合使用了这些策略，通过减少延伸时间来加速PCR热循环，同时实现高产量和增强特异性。
章节摘录
材料
Pfu DNA聚合酶基因由Addgene公司提供（ID 12509）。sso7d基因由Genscript公司（美国新泽西州Piscataway）合成，TneSSB基因由Bionics公司（韩国首尔）合成，用于E. coli的优化。dUTPase酶由Elpis Biotech公司（韩国大田）提供。Lambda噬菌体DNA从Thermo Scientific公司（美国马萨诸塞州Waltham）购买。引物/探针由Bionics公司（韩国首尔）、CosmoGenetech公司（韩国首尔）和IDT公司（美国爱荷华州）合成。
构建Pfu和Pfu-sso7d表达质粒
首先使用含有5′端25-bp attB序列的引物通过PCR扩增Pfu基因（1689 bp）。为了生成入口克隆（attL1-Pfu-attL2），使用BP Clonase? II酶混合液（Elpis Biotech公司，韩国大田）根据制造商的说明将attB标记的PCR产物与pDONR207载体的attP位点重新组合。随后，由GenScript公司（美国新泽西州）合成了一种针对E. coli表达的经过密码子优化的sso7d基因（147 bp），并将其融合到C末端。
构建Pfu、Pfu-sso7d融合体和TneSSB
为了评估纯化DNA聚合酶的扩增活性，设计了两种不同的Pfu和Pfu-sso7d构建体（图1）。Pfu和sso7d的蛋白质序列见补充表S1。Pfu和Pfu-sso7d融合体的克隆过程见补充图S1。为了解决纯化Pfu-sso7d表达水平较低的问题，在T7启动子中引入了Shine-Dalgarno（核糖体结合位点）和T7共有序列。
讨论
通过一个快速高效的三步纯化过程——包括热变性、固定化金属亲和层析（IMAC）和透析——我们成功获得了纯度超过90%的Pfu–sso7d融合聚合酶（图3A）。纯化的酶表现出高扩增效率，能够有效扩增长达15 kb的DNA片段（图8E）。相比之下，Farooqui等人（Farooqui等人，2023年）采用了简化的纯化方法。
结论
Pfu–sso7d是一种高保真度的DNA聚合酶，其准确度远高于Taq，可以快速高效地纯化，非常适合小型研究实验室或希望生产用于DNA克隆和蛋白质表达的酶的公司。这种聚合酶的性能经常与商业酶相当甚至更优，能够支持长达约15 kb的片段的长距离扩增。对于特别具有挑战性的长距离目标（≥ 8 kb），我们发现添加...
CRediT作者贡献声明
Huynh Kim Khanh Ta：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。 Thi Luong Vu：研究。 Do Hyung Kim：研究。 Hye Ji Shim：研究。 Bich Hang Do：研究。 Lan Thuy Ty Nguyen：研究。 Han Choe：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（KNRF-2019067449）的资助。
