《Journal of Chromatography A》：A sequential esterification–deesterification strategy for agarose microspheres with expanded network and high ligand density toward lysozyme purification
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•顺序酯化-脱酯调控琼脂糖网络。•临时酯化扩大琼脂糖微球的内部孔结构。•交联/脱酯显著保留扩大的孔结构。•环氧基密度和离子交换配体密度显著增加。•OSAAM-SP表现出高吸附容量和动态结合性能。引言琼脂糖是目前应用最广泛的天然多糖基质之一，用于蛋白质色谱介质。早期的研究表明，
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顺序酯化-脱酯调控琼脂糖网络。
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临时酯化扩大琼脂糖微球的内部孔结构。
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交联/脱酯显著保留扩大的孔结构。
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环氧基密度和离子交换配体密度显著增加。
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OSAAM-SP表现出高吸附容量和动态结合性能。
引言
琼脂糖是目前应用最广泛的天然多糖基质之一，用于蛋白质色谱介质。早期的研究表明，琼脂糖凝胶微球具有良好的亲水性、低的非特异性吸附和高的生物相容性，使其适用于多种分离模式，包括凝胶过滤、离子交换、亲和和疏水相互作用色谱[1,2]。据报道，琼脂糖基色谱介质的分离性能受两个关键因素的影响：基质骨架的孔径分布，决定了溶质扩散速率；以及表面功能配体的密度，影响静态和动态结合容量[3,4]。具体而言，孔结构决定了蛋白质在介质中的扩散性，而功能配体密度则决定了平衡吸附容量和动态结合容量[5,6]。然而，在凝胶化过程中，琼脂糖通过分子间氢键形成双螺旋聚集体和三维网络。这种结构对于凝胶的稳定性至关重要，但它也促进了局部链的堆积，限制了内部羟基的可及性[7,8]。对于基于羟基的活化反应，如环氧化反应，这种致密的网络可能会阻碍试剂的接近，导致活化分布不均匀，表面附近的修饰程度高于内部[9]。结果，配体负载容量和动态结合容量可能会受到影响。
为了解决功能位点可及性有限的问题，通常使用两种主要策略。一种是引入富羟基间隔臂或分支段，如右旋糖酐或PEG，以增加偶联位点的数量并提高配体密度[10]。例如，Xue等人[11]将富羟基右旋糖酐接枝到Sepharose FF上，增加的羟基含量显著提高了DEAE配体密度并加速了hIgG的吸附。Chudasama等人[12]将PEG链引入琼脂糖，增加了可用的羟基数量，实现了BSA的高效可逆结合。Qiao等人[13]利用纤维素微球的羟基作为DEAE-右旋糖酐接枝的锚定位点，显著提高了配体负载量和偶联效率。Zhang等人[14]将水性聚氨酯接枝到具有高表面羟基密度的中空聚苯乙烯微球上，展示了富羟基基质在高效化学修饰方面的价值。另一种方法侧重于通过交联或优化制备过程来调控孔结构，以改善微球骨架的孔结构和比表面积，从而改善反应位点的可及性。例如，Zhao等人[6]通过预交联结合表面活性剂胶束溶胀制备了高度交联的微孔琼脂糖微球，显著提高了内部孔的开放度和机械稳定性。Xiao等人[15]采用环状酸酐预交联方法，改善了孔的连通性并增强了流体渗透性。Wang等人[16]将高温乳化与低温凝胶化相结合，制备了具有均匀形态和开放孔结构的琼脂糖微球，有效改善了其功能化潜力和色谱性能。这些研究表明，引入额外的反应位点或优化孔结构可以改善多糖基材料的功能化。最近，旨在直接增加固有羟基位点可及性的策略引起了越来越多的关注。深共晶溶剂（DES）处理可以破坏氢键相互作用并重排纤维素的超分子结构，从而提高基质的可及性[17]，而酶预处理可以打开致密的多糖结构并增强羟基的可及性和反应性，以便进行后续化学功能化[[18], [19], [20]]。然而，这些方法主要是为纤维素或木质纤维素开发的，并且通常涉及溶剂介导的结构重构或部分酶促降解。对于预制的琼脂糖色谱微球，在增加内部羟基可及性的同时保持柱操作所需的孔网络和机械完整性仍然具有挑战性。因此，一种可逆的结构调控策略非常理想，它可以暂时破坏氢键结合的琼脂糖网络，暴露内部反应位点，然后恢复这些位点并稳定扩大的结构。
近年来，研究表明，多糖链之间的分子间相互作用和凝胶孔结构可以通过化学修饰来调节[21]。酸酐酯化是一种常用的多糖修饰方法，将酰基侧链引入羟基，通过位阻增加链之间的平均距离，改变局部氢键环境，并调节亲水/疏水平衡。Wei等人[22]指出，氢键是推动凝胶网络形成的关键力之一，酯化度的变化直接影响分子间非共价相互作用网络。Chi等人[23]发现，乙酰化可以改变淀粉的分子间氢键和结晶结构。Xiao等人[24]证实，在琼脂糖与琥珀酸酐的反应过程中，引入的基团破坏了分子间氢键，导致多糖网络重构。Zhang等人[25]进一步证明，酸酐的碳链长度和不饱和度都影响短链酸酐酯化琼脂糖的疏水相互作用和氢键，从而改变凝胶网络结构。这些发现表明，酸酐酯化不仅仅是一种引入功能团的化学手段，还可能提供一种有效的方法来调节琼脂糖的超分子结构，并可能改善内部反应位点的可及性。更重要的是，临时引入和随后去除酯基提供了一种顺序网络调控的潜在途径，即酯化诱导网络扩展，然后通过脱酯恢复临时酯化的羟基，并通过交联辅助稳定扩大的结构。
因此，如图1所示，本研究提出了一种顺序酯化-脱酯策略，以构建具有扩大网络结构和高密度功能化位点的琼脂糖基阳离子交换介质。首先，使用具有不同分子结构的酸酐对琼脂糖进行临时酯化。酸酐衍生的取代基的引入扰乱了琼脂糖基质内的分子间相互作用，导致内部网络扩展和孔尺寸增加。随后，在碱性条件下对酯化微球进行BDDE介导的交联，在此期间，临时酯基通过碱性脱酯去除，同时共价交联稳定了琼脂糖网络。所得的脱酯微球保留了相对扩大的孔结构，同时恢复了临时酯化的羟基。后续的环氧化和功能化产生了带有磺酸基（–SO??）的强阳离子交换介质，具有高离子交换配体密度。因此，这种顺序策略整合了临时网络扩展、交联辅助结构稳定和临时酯化位点的恢复，从而促进了后续功能化和色谱传质。基于此策略，我们系统地研究了不同酸酐结构对琼脂糖微球的孔结构、环氧基密度和离子交换性能的影响，并评估了所得介质从鹌鹑蛋清中纯化溶菌酶的能力。
章节摘要
材料与试剂
琼脂糖（Mw 280 kDa，硫酸盐含量0.23%，凝胶强度2000 g/cm2）由厦门普思威尔生物工程公司提供。本研究中使用的所有试剂均为分析纯。乙酸酐（AA）、琥珀酸酐（SA）、辛烯琥珀酸酐（OSA）、无水乙醇、酚酞、盐酸（HCl）、溴化钾（KBr，色谱级）、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、环氧氯丙烷、磷酸氢二钠十二水合物和钠
酯化琼脂糖的表征
本研究系统地比较了琼脂糖与三种不同结构的酸酐，即乙酸酐（AA）、琥珀酸酐（SA）和辛烯琥珀酸酐（OSA）的酯化反应，在相同的反应条件下，旨在通过引入酸酐衍生的侧基来扰乱琼脂糖分子链之间致密的氢键网络，从而调控琼脂糖网络结构。图2a展示了示意图的
结论
本研究通过顺序酸酐酯化-脱酯策略开发了一种高性能的琼脂糖基阳离子交换微球，为克服传统琼脂糖基质致密氢键网络导致的内部位点可及性有限问题提供了一条有效途径。在所研究的酸酐中，OSA产生了最显著的网络扩展，同时保持了微球成形所需的足够结构完整性，这
CRediT作者贡献声明
陈梓洲：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，方法论，形式分析。龙晓菊：撰写 – 初稿，调查研究，形式分析。赵子婷：调查研究，形式分析。肖琼：可视化，资助获取。张倩：项目管理，资助获取。翁惠芬：可视化，数据整理。陈军：形式分析。张永辉：项目管理。肖安丰：监督，方法论，资助获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能会影响本论文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金的资助：22578160，22278173；福建省校企合作项目：2026Y4011。
陈梓洲|龙晓菊|赵子婷|肖琼|张倩|翁惠芬|陈军|张永辉|肖安丰
