《Journal of Chromatography B》：Simultaneous quantification of remimazolam, midazolam, 1′-hydroxymidazolam, and dexmedetomidine in rat plasma by LC-MS/MS: application to biological samples and partial validation in ECMO-derived plasma
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•同时LC–MS/MS定量分析瑞马唑仑、咪达唑仑、1′-OH-咪达唑仑和右美托咪定。•采用酯酶抑制样品处理策略，实现了50 μL血浆中瑞马唑仑的稳定分析。•在ECMO来源的血浆样本中初步展示了适用性。引言瑞马唑仑（RMZ）是一种超短效苯二氮?类镇静催眠药，经血浆酯酶迅速水解为
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同时LC–MS/MS定量分析瑞马唑仑、咪达唑仑、1′-OH-咪达唑仑和右美托咪定。
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采用酯酶抑制样品处理策略，实现了50 μL血浆中瑞马唑仑的稳定分析。
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在ECMO来源的血浆样本中初步展示了适用性。
引言
瑞马唑仑（RMZ）是一种超短效苯二氮?类镇静催眠药，经血浆酯酶迅速水解为其无活性的羧酸代谢物（CNS7054）[1]、[2]、[3]。尽管其有利的药代动力学特性使其在程序性镇静、全身麻醉和重症监护领域的应用不断扩大，但该化合物在大鼠血浆中尤为不稳定，因为大鼠的酯酶活性显著高于人类。这一生化特性导致体外降解迅速，使得若不严格控采集血和样品制备，则难以准确定量RMZ [2]。因此，在分析流程中必须实施酯酶抑制策略，以防止RMZ的人为损失。然而，迄今为止，尽管酯酶抑制方法已用于其他酯酶敏感化合物的研究，但较少有分析方法针对RMZ在大鼠血浆中的特殊不稳定性进行了探讨，且尚无完全验证的液相色谱-电喷雾正离子串联质谱法（LC-MS/MS）建立了确保RMZ在大鼠血浆中稳定性的稳健框架。
在临床前药理学和麻醉学研究中，RMZ经常与其他镇静剂联合使用或进行比较，最值得注意的是咪达唑仑（MDZ）和右美托咪定（DEX）。MDZ通常用于比较麻醉药物谱或作为辅助镇静剂，主要经肝脏细胞色素P450 3 A酶转化为具有药理活性的代谢物1′-羟基咪达唑仑（1'-OH-MDZ）。该代谢物保留了显著的药理活性，并有助于总体镇静效果，尤其在药物处置改变或代谢物清除受损的条件下[4]。DEX提供互补的α2-肾上腺素能镇静镇痛作用。
尽管这些药物在重症监护管理中经常使用，并且在比较药代动力学和镇静研究中备受关注（表1），但它们可能按顺序给药或在镇静管理的不同阶段使用，包括机械通气和支持性体外膜氧合（ECMO）期间，此时由于血液稀释、蛋白质结合改变和体外回路内药物蓄积，药物处置可能变得高度不可预测[5]、[6]，导致高度可变且难以预测的药代动力学。因此，同时进行多分析物定量可能有助于在ECMO条件下全面评估镇静药物，并利用ECMO来源的血浆验证分析性能。尽管它们具有重要的临床和实验意义，但能够在大鼠血浆小体积中同时定量RMZ、MDZ、1'-OH-MDZ和DEX的分析方法仍然有限。因此，开发一种能够同时定量这些化合物的单一LC–MS/MS方法，将有助于未来在重症患者（包括接受ECMO支持者）中的药代动力学研究。
迫切需要一种灵敏、选择性高且注重稳定性的LC-MS/MS方法，能够同时定量大鼠血浆中的RMZ、MDZ、1'-OH-MDZ和DEX。尽管已报道了多种测定血浆中MDZ、1'-OH-MDZ或DEX的LC-MS/MS方法，但大多数检测方法是为单一分析物或特定药代动力学应用而开发的，通常需要独立的分析平台[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。迄今为止，很少有已发表的方法解决RMZ在大鼠血浆中的不稳定性问题。因此，目前尚无同时定量RMZ、MDZ、1'-OH-MDZ和DEX并能维持RMZ稳定性的整合检测方法可用。此外，尚无研究使用ECMO来源的血浆评估这些分析物，这为重症监护模型的分析方法学留下了重要空白（表2）。
因此，本研究旨在开发并验证一种LC-MS/MS方法，用于同时测定大鼠和ECMO来源血浆中的RMZ、MDZ、1'-OH-MDZ和DEX，并展示其在生物样本中的适用性。该检测方法通过纳入优化的酯酶抑制样品处理策略来解决RMZ的内在不稳定性，并为未来临床前重症监护模型中的药代动力学研究提供平台。据我们所知，很少有已发表的LC-MS/MS方法在纳入RMZ稳定化程序的同时定量RMZ、MDZ、1'-OH-MDZ和DEX，并在ECMO来源的血浆中评估分析性能。这种整合方法解决了RMZ的内在不稳定性，并提供了该检测方法适用于ECMO来源血浆的初步证据。此外，该方法仅需要少量血浆体积，使其特别适用于小动物模型的临床前研究。这些特性可能提高检测方法的适用性，并支持未来在ECMO模型中的药代动力学研究。本研究旨在建立临床前ECMO药代动力学研究的实用分析平台，而非研究这些镇静药物之间的药物相互作用。
章节摘要
化学品和试剂
RMZ（甲苯磺酸盐注射液制剂；Anerem?）、MDZ、1'-OH-MDZ和DEX（纯度≥98%）的参考标准品，以及内标（IS；洛沙品，纯度≥98%）购自和光纯药工业株式会社（日本大阪）。有机溶剂和添加剂，包括乙腈、甲醇和甲酸（99%），也从同一制造商处获得。液相色谱级乙腈、甲醇、超纯水以及甲酸在整个研究过程中使用。
色谱选择性
空白大鼠血浆、LLOQ血浆和含有所有分析物及内标的生物血浆样本的典型色谱图见图1。在空白血浆中，目标分析物或内标的保留时间处未观察到干扰性内源性峰。在LLOQ加标血浆样本中，所有分析物均显示出轮廓清晰、对称的峰形，其信噪比足以实现可靠的定量分析。内标的色谱响应保持稳定。尽管洛沙品显示出
讨论
建立并验证了一种快速、选择性的LC-MS/MS方法，该方法纳入注重稳定性的样品处理，用于在有限体积的大鼠血浆中同时定量RMZ、MDZ、1'-OH-MDZ和DEX。该检测方法有若干方法学特征使其与先前报道的方法不同，包括同时定量RMZ、MDZ、1'-OH-MDZ和DEX、纳入针对RMZ的稳定化策略，以及使用ECMO来源血浆进行部分验证。
尽管
CRediT作者贡献声明
Rina Kakuba：撰写—原始稿件、可视化、验证、方法学、形式分析、数据管理。Yuhki Sato：撰写—审阅与编辑、方法学、概念设计。Yu Fujii：验证、形式分析。Yuka Nagatsuka：撰写—审阅与编辑。Takuya Abe：撰写—审阅与编辑、验证。Yutaka Fujii：撰写—审阅与编辑、验证、监督、方法学、概念设计。
写作过程中生成式人工智能及AI辅助技术的声明
在撰写本稿件过程中，作者使用ChatGPT（OpenAI）帮助改善稿件的清晰度和可读性。使用该工具后，作者对内容进行了审阅和编辑，并对稿件内容承担全部责任。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本论文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
Rina Kakuba|Yuhki Sato|Yu Fujii|Yuka Nagatsuka|Takuya Abe|Yutaka Fujii
