口服氟化β-葡聚糖/果胶纳米凝胶递送Astilbin调控衰老相关CD4+ T细胞并促进Foxp3+ Treg诱导改善老年结肠炎小鼠

《Advanced Science》：Oral Astilbin Nanogels Modulate Senescence-Associated CD4+ T Cells and Promote Treg Induction in Aged Mice with Colitis

老年人群中的炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）以免疫衰老和肠道稳态恶化为特征，二者均限制当前疗法的疗效。在此，研究人员开发了氟化β-葡聚糖/果胶纳米凝胶（fluorinated β-glucan/pectin nanogels, F2-Ast@NGs），用于口服递送Astilbin（Ast），一种具有抗炎和免疫调节活性的天然黄酮类化合物。该多功能平台整合了胃肠道保护、结肠靶向释放和局部免疫调节。β-葡聚糖壳在上消化道转运期间保持纳米凝胶稳定性，同时在结肠中实现β-葡聚糖酶响应性解组装。氟碳链段增强黏液穿透，果胶基质延长结肠滞留，促进药物在炎症部位蓄积。在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）诱导的老年结肠炎小鼠中，F2-Ast@NGs减轻疾病严重程度，减弱结肠CD4⁺ T细胞的衰老相关特征，并增强Foxp3⁺调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）应答。同时，β-葡聚糖/果胶纳米凝胶基质有助于增加短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）产生和改善肠道微生物组成。值得注意的是，F2-Ast@NGs的治疗效果在Foxp3⁺ Treg耗竭小鼠中显著减弱，支持Treg介导的免疫调节发挥重要作用。总体而言，F2-Ast@NGs实现精准结肠递送，同时协同重塑肠道免疫和微生物微环境，为老年宿主结肠炎提供了一种有前景的口服纳米治疗策略。

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和克罗恩病（Crohn's disease, CD），是慢性免疫介导的胃肠道疾病。全球老龄化使老年起病IBD（诊断年龄≥60岁）成为临床挑战，老年肠道微环境存在上皮再生受损、微生物失调和黏膜通透性增加，免疫衰老和虚弱限制免疫抑制与生物制剂应用。CD4⁺ T细胞在发病中居中心，衰老导致胸腺退化、初始T细胞池收缩和衰老效应/记忆亚群积累，分泌IL-17等促炎因子；老年结肠组织中衰老CD4⁺ T细胞具有高衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）活性，并高表达程序性死亡受体-1（programmed death-1, PD-1）。Astilbin（Ast）为从Smilax glabra Roxb.提取的黄酮苷，具抗炎、抗衰老和免疫调节作用，但口服生物利用度<1%，受溶解性差、胃肠道不稳定和吸收低限制。因此，研究人员构建氟化β-葡聚糖/果胶纳米凝胶（F2-Ast@NGs），研究其口服递送、结肠靶向及对老年结肠炎衰老相关CD4⁺ T细胞和Treg的作用。论文发表在《Advanced Science》。

关键技术方法方面，研究人员利用Gene Expression Omnibus（GEO）公共转录组数据，纳入106例结肠炎患者分析PDCD1表达与年龄关系；建立年轻和老年C57BL/6小鼠DSS诱导结肠炎模型及Foxp3-IRES-DTR Treg耗竭模型；制备F2-Ast@NGs及系列纳米凝胶，进行粒径、Zeta电位、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）包封与释放、β-葡聚糖酶响应释放、黏液穿透、多粒子追踪（multiple particle tracking, MPT）、活体成像系统（in vivo imaging system, IVIS）分布、流式细胞术（flow cytometry, FC）、RNA测序、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、实时定量PCR、16S rDNA测序、SCFAs气相色谱、组织学和安全性评价。

在结果部分，2.1“衰老通过衰老相关CD4⁺ T细胞功能障碍加重结肠炎”中，研究人员通过GEO数据发现PDCD1表达与年龄正相关，老年患者高于年轻患者；在老幼DSS模型中，老年小鼠体重下降、疾病活动指数（disease activity index, DAI）、IL-17A和组织学评分更高，结肠更短；FC显示老年结肠CD4⁺ T细胞PD-1、SA-β-gal和P21升高，Treg补偿不足；过继转移老年结肠炎供体CD4⁺ T细胞加重受体病情，表明衰老与结肠炎协同增强CD4⁺ T细胞衰老特征。

2.2“Ast减弱CD4⁺ T细胞衰老相关特征并促进Treg诱导”中，体外Ast降低PD-1，500 ng mL^?1最大抑制，降低P21，促进增殖和Foxp3⁺ Treg诱导；体内高剂量100 mg kg^?1有效，降低CD4⁺PD-1⁺、SA-β-gal⁺、P21⁺并增加Treg；RNA测序显示衰老相关基因Glb1、Cdkn1a、Trp53inp1、Cdkn2a及促炎基因Rela、Tnf、Il6、Il1b下调，Tgfb1、Il10、Foxp3上调，TGF-beta通路富集，AGE-RAGE在DSS组富集，提示Ast改善免疫稳态。

2.3“F-Ast@NGs表征及β-葡聚糖酶响应释放”中，研究人员通过静电、疏水、配位作用制备核并以β-葡聚糖包覆；粒径随全氟辛酸（perfluorooctanoic acid, PFOA）增加为628–871 nm，TEM显示球形400–600 nm，Zeta降低，包封率>80%，多分散指数（polydispersity index, PDI）<0.3；β-葡聚糖壳在上消化道pH和胆盐中稳定，释放<15%，未包覆者泄漏；小鼠胃肠道液中包覆者主要大肠释放，β-葡聚糖酶在盲肠/结肠活性高，F2-Ast@NGs在PBS释放<20%，酶中约78%，表明壳减少早释并实现结肠酶响应释放。

2.4“F-Ast@NGs黏液穿透与黏膜黏附”中，黏蛋白聚集实验显示F-Ast@NGs降低黏蛋白吸附；MPT中F2/F3扩散最大，F2的均方位移（mean squared displacement, MSD）最高；离体结肠F2荧光高于Ast@NGs 5.5倍；transwell中F2基底室荧光最高；HT29细胞F2荧光最高，果胶介导黏膜黏附，故F2被选为优化制剂。

2.5“F2-Ast@NGs在炎症结肠中增强滞留”中，Cy5标记口服后，游离Cy5快速清除，F2在结肠滞留达48 h，12、24、48 h荧光强度分别高1.2、2.0、2.3倍，曲线下面积高1.8倍；冰冻切片和3D共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）显示F2穿透黏液层，而Ast@NGs多限于腔，表明F2增强递送和蓄积。

2.6“F2-Ast@NGs有效治疗结肠炎小鼠”中，年轻和老年DSS模型中F2改善便血、DAI、体重、结肠长度和脾肿大，组织学评分降低，紧密连接蛋白claudin-1恢复，老年效果更明显；降低IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17A，增加IL-10、TGF-β；FC显示减少CD4⁺PD-1⁺、SA-β-gal⁺、P21，增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg，降低IL-17A⁺CD4⁺、TNF-α⁺F4/80⁺巨噬细胞和TNF-α⁺CD11c⁺树突细胞。

2.7“调控肠道SCFAs和微生物群”中，老年小鼠乙酸、丙酸、丁酸、戊酸降低，NGs后升高，F2最高；16S rDNA显示DSS改变α/β多样性，F2接近健康，操作分类单元增加；门水平抑制Proteobacteria、富集Bacteroidota；属水平降低Escherichia-Shigella、Turicibacter，增加Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Odoribacter、Alloprevotella，提示有利菌群改变，但样本量有限。

2.8“F2-Ast@NGs介导CD4⁺ T细胞调控机制”中，空NGs仅部分改善且不降低PD-1/SA-β-gal；F2优于5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid, 5-ASA），5-ASA不显著改变衰老CD4⁺ T细胞；F2降低CD27^?CD28^?CD4⁺ T。分选衰老相关（CD28^?CD27^?）和非衰老相关CD4⁺ T细胞后，Ast优先降低衰老相关细胞PD-1和代谢活性，促进非衰老相关细胞向Foxp3⁺Treg分化约5倍，降低衰老相关IL-17A。阻断性抗PD-1抗体（anti-PD-1 antibody, aPD-1）未缓解甚至加重，并部分削弱F2疗效；激动性aPD-1不能阻止Ast降低CD27^?CD28^?细胞，表明Ast作用不限于PD-1通路。

2.9“Foxp3⁺Treg在F2疗效中的必需作用”中，Treg耗竭小鼠结肠炎更重，F2疗效显著减弱，组织损伤重；过继转移F2处理小鼠CD4⁺CD25⁺T细胞较Ast@NGs处理减轻DAI和结肠缩短，增加Treg并重塑细胞因子；来自Foxp3⁺Treg缺陷供体则保护显著降低，表明F2依赖Foxp3⁺Treg免疫调节。

2.10“NGs的生物安全性评价”中，溶血<7%，肝肾功能和血常规正常，肠道和主要器官H&E无明显异常；三周重复给药无体重下降、生化、血常规和肠道组织异常。讨论指出PFOA长期安全性需评估，PEG化可能替代但存在抗PEG免疫反应，需更长重复给药研究。

讨论与结论部分翻译如下：总之，研究人员成功开发了氟化纳米凝胶制剂F2-Ast@NGs，有效克服Ast的胃肠道不稳定性，并实现炎症结肠靶向释放。β-葡聚糖壳提供酸和胆盐降解保护，同时允许结肠中β-葡聚糖酶响应性解组装；两疏氟碳链段促进高效黏液穿透，黏膜黏附果胶延长结肠滞留，确保炎症部位持续药物蓄积。机制上，Ast差异调节不同CD4⁺ T细胞群体，优先抑制衰老相关CD4⁺ T细胞的代谢活性和促炎表型，同时促进非衰老相关CD4⁺ T细胞向Treg分化，恢复免疫稳态并减轻肠道炎症。同时，β-葡聚糖/果胶纳米凝胶基质增加SCFAs产生并有利改变肠道微生物组成，提供补充益处。总体而言，该研究突显一个整合胃肠道保护、黏液穿透、微生物群调节和局部免疫调节的多功能NG平台，可实现老年宿主结肠炎的精准和持续治疗；为设计针对慢性炎症性疾病的微生物响应和免疫调节口服纳米药物提供了框架。未来需进一步阐明Ast介导CD4⁺ T细胞调控的分子机制，并评估长期生物安全性和治疗反应持久性。