小胶质细胞PBRM1缺陷经CCL5-CCR1/5-β-catenin信号轴驱动过度神经发生与孤独症样行为

《Advanced Science》：PBRM1 Deficiency in Microglia Leads to Excessive Neurogenesis and Autism-Like Behaviors via the CCL5-CCR1/5-β-catenin Signaling Axis

孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）是一种异质性神经发育障碍，有效治疗药物有限，其患病率在全球范围内呈上升趋势。Polybromo 1（Pbrm1）是SWI/SNF（switch/sucrose non-fermentable，转换/蔗糖不发酵）染色质重塑复合物的核心组分，其错义突变已被确定为ASD的风险因素；然而，PBRM1功能缺失是否参与发病机制仍不清楚。研究人员提供了直接证据表明，小胶质细胞PBRM1缺陷可导致小鼠小胶质细胞簇改变、过度神经发生和ASD样行为。整合分子分析显示，PBRM1直接结合Ccl5启动子并抑制CCL5的表达。升高的CCL5通过CCR1/5-β-catenin信号通路促进神经干/祖细胞（neural stem/progenitor cells, NSPCs）的增殖和神经元分化。重要的是，药理学阻断CCR1/5可改善Pbrm1 cKO小鼠的行为缺陷。总之，这些发现揭示了一种先前未被认识的小胶质细胞–NSPC通讯机制，将PBRM1功能障碍与异常神经发育联系起来，并提示CCL5–CCR1/5轴是ASD的潜在治疗靶点。

**小胶质细胞PBRM1缺陷驱动过度神经发生与孤独症样行为的机制研究**

**一、研究背景与科学问题**

孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）是一类以重复行为和社交沟通障碍为核心的异质性神经发育疾病，全球患病率持续攀升，但有效治疗药物十分有限。遗传学研究显示，约10%–30%的ASD病例可归因于数百个基因的变异，其中编码哺乳动物SWI/SNF（switch/sucrose non-fermentable）染色质重塑复合物（又称BAF复合物）亚基的基因是反复出现的风险位点。PBRM1（Polybromo 1，也称BAF180）作为该复合物的核心组分，其罕见错义变异已在散发ASD患者中被报道，但PBRM1功能缺失是否真正参与ASD发病机制尚不清楚。小胶质细胞作为脑内常驻免疫细胞，通过突触修剪和神经发生调节参与正常脑发育，并与ASD病理密切相关；海马则是出生后神经发生的主要脑区，在ASD中呈现结构和功能异常。然而，小胶质细胞PBRM1在神经发育中的细胞类型特异性功能及其分子机制仍属空白。为此，研究人员构建了小胶质细胞特异性Pbrm1条件敲除小鼠，系统探究PBRM1在脑发育及ASD样行为中的作用。

**二、研究内容与总体结论**

研究人员通过将Pbrm1 flox/flox小鼠与Cx3cr1-Cre小鼠交配，获得小胶质细胞特异性Pbrm1条件敲除（Pbrm1 cKO）小鼠，并结合多组学分析、分子生物学、电生理及行为学手段，发现小胶质细胞PBRM1缺失导致小胶质细胞簇异常、海马过度神经发生、树突棘密度增加及ASD样行为。机制上，PBRM1直接结合Ccl5启动子并抑制其转录；升高的CCL5通过CCR1/5-β-catenin信号轴促进神经干/祖细胞（neural stem/progenitor cells, NSPCs）增殖和神经元分化。药理学阻断CCR1/5可显著改善Pbrm1 cKO小鼠的行为缺陷。该研究揭示了一条全新的小胶质细胞–NSPC通讯机制，为理解PBRM1功能障碍相关ASD的发病机制提供了重要见解，相关成果发表于《Advanced Science》。

**三、主要关键技术方法**

该研究使用多种模式动物与前沿技术。动物模型包括：小胶质细胞特异性Pbrm1条件敲除小鼠（Cx3cr1-Cre^+/?;Pbrm1^flox/flox）、小胶质细胞特异性Pbrm1与Ccl5双敲除小鼠（Pbrm1 dcKO）、Nestin-GFP和Thy1-GFP报告小鼠，以及人胚胎干细胞（human embryonic stem cell, hESC, WA09）来源的小胶质细胞样细胞（human microglia-like cells, hMGLs）。核心方法涵盖：单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq, 10× Genomics平台）、转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq）、常规转录组测序（bulk RNA-seq）、染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR, ChIP-qPCR）、双荧光素酶报告基因实验、Transwell间接共培养体系、脑立体定位注射、全细胞膜片钳记录及系列行为学范式。所有动物实验均经中国科学院动物研究所动物伦理委员会批准。

**四、研究结果**

**2.1 小胶质细胞PBRM1缺失导致小鼠ASD样行为**
通过开放场试验（open field test, OFT）和高架十字迷宫实验（elevated plus maze test, EPM）发现，Pbrm1 cKO小鼠表现出明显的焦虑样行为；三箱社交试验显示其社交能力和社交新颖性降低；自我理毛和埋珠试验显示重复刻板行为增加。空间学习与工作记忆未见异常，但新物体识别记忆受损。

**2.2 Pbrm1 cKO小鼠海马神经源性微环境改变**
scRNA-seq鉴定出包括小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞、神经干细胞（neural stem cells, NSCs）等八种主要细胞类型。CellChat分析显示Pbrm1 cKO小鼠小胶质细胞与NSCs之间的信号通讯数量和强度均增加，且小胶质细胞与NSPCs的空间毗邻比例升高。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示NSCs中增殖和神经元分化通路显著上调。

**2.3 Pbrm1 cKO小鼠过度神经发生**
BrdU标记实验显示Pbrm1 cKO小鼠海马齿状回（dentate gyrus, DG）中BrdU⁺SOX2⁺Nestin-GFP⁺ NSPCs、DCX⁺BrdU⁺未成熟神经元及NeuN⁺BrdU⁺成熟神经元数量均显著增加；体外共培养和人hMGLs-类器官实验进一步证实PBRM1缺陷小胶质细胞可促进NSPC增殖与神经元分化。逆转录病毒标记显示新生神经元树突长度和分支增加；电生理记录发现兴奋性/抑制性突触比（E/I比）升高；Western blotting检测到β-catenin、p-AKT和p-PI3K水平上调，提示Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路激活。

**2.4 抑制神经发生挽救Pbrm1 cKO小鼠ASD样行为**
给予抗有丝分裂药物替莫唑胺（temozolomide, TMZ）处理可显著减少Pbrm1 cKO小鼠DG中过度增多的未成熟和成熟神经元，并改善其社交缺陷，表明过度神经发生是ASD样行为的重要原因。

**2.5 Pbrm1 cKO小鼠小胶质细胞簇改变**
scRNA-seq将小胶质细胞分为MG0–MG6七个亚簇。Pbrm1 cKO小鼠中MG1（促炎亚簇，高表达Tnf和Nfkbia）比例显著增加（48.8%），而稳态亚簇MG0（高表达Tmem119和P2ry12）比例下降。拟时间分析显示cKO小胶质细胞富集于早期发育阶段。流式细胞术证实IL-1α⁺TNF-α⁺双阳性小胶质细胞增多，且该亚群可促进NSPC向神经元分化，被确定为关键致病群体。

**2.6 小胶质细胞CCL5驱动过度神经发生和社交缺陷**
整合scRNA-seq、ATAC-seq和bulk RNA-seq分析，筛选出包括Ccl5在内的11个共同上调基因。CCL5在Pbrm1 cKO小胶质细胞中mRNA和蛋白水平均显著升高，且主要来源于MG1亚簇。重组CCL5蛋白可促进NSPC增殖和神经元分化，而CCL5中和抗体可阻断该效应。在Pbrm1 cKO背景下进一步敲除Ccl5（Pbrm1 dcKO）完全挽救了过度神经发生和社交缺陷，证明CCL5是关键下游效应分子。

**2.7 PBRM1结合Ccl5启动子并抑制其转录**
ATAC-seq显示cKO小胶质细胞Ccl5启动子区域染色质可及性增加。ChIP-qPCR证实PBRM1直接结合Ccl5启动子上游两个位点，结合序列为A(T)A(T)C AAA(T)G。双荧光素酶报告实验表明PBRM1过表达抑制Ccl5启动子活性，而突变该结合基序后抑制作用消失。该调控不依赖典型SWI/SNF复合物核心亚基BRG1和组蛋白H3K14ac。

**2.8 CCL5-CCR1/5激活β-catenin信号驱动过度神经发生**
CCL5受体CCR1和CCR5在NSPCs中均有表达。在Transwell共培养体系中，分别或同时使用CCR1抑制剂BX471和CCR5抑制剂马拉维罗（maraviroc）均可抑制Pbrm1 cKO小胶质细胞诱导的NSPC增殖和神经元分化，且联合抑制能显著降低p-β-catenin（Y552）、p-AKT和p-PI3K水平。体内腹腔注射两种抑制剂同样减少了cKO小鼠海马中过度增殖和分化的神经细胞。

**2.9 药理学抑制CCR1/5挽救Pbrm1 cKO小鼠ASD样行为**
马拉维罗和BX471联合给药显著增加Pbrm1 cKO小鼠在开放场中心区域和EPM开放臂的停留时间，改善三箱社交试验中的社交能力，并减少埋珠数量，提示CCR1/5拮抗剂可缓解焦虑样和ASD样行为。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，PBRM1在维持小胶质细胞稳态中发挥关键作用，其缺失导致小胶质细胞向促炎亚群偏移并异常分泌CCL5。以往研究多关注CCL5的免疫趋化功能，而本研究首次揭示其直接调控NSPC行为的神经生物学功能。临床报道ASD儿童血浆CCL5水平升高，支持CCL5在ASD发病中的潜在意义。尽管CCR1/5拮抗剂显著改善表型，但未能完全逆转，提示TGF-β、半乳糖凝集素等其他信号通路也参与其中，ASD的病理机制具有网络复杂性。

研究结论：本研究鉴定出小胶质细胞PBRM1是调控NSPC增殖和神经元分化的关键因子，建立了一条PBRM1–CCL5–CCR1/5信号轴，将小胶质细胞功能障碍与过度神经发生及ASD样行为联系起来。这些发现为理解染色质重塑缺陷导致神经发育障碍的机制提供了新视角，并提示CCL5–CCR1/5通路是PBRM1功能障碍相关ASD的潜在治疗靶点。