《Journal of Ethnopharmacology》：Tibetan medicine
Anzhi Jinghua San alleviates chronic atrophic gastritis: attenuation of LysoPC-induced Bcl-2 suppression and inhibition of pyroptosis and apoptosis
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摘要专业翻译
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是一种常见的慢性炎症性胃病，以胃黏膜腺体丧失为特征，常伴有纤维化、肠上皮化生和假幽门腺化生。藏药安智精华散（Anzhi Jinghua San，AZJHS）是治疗CAG
摘要专业翻译
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是一种常见的慢性炎症性胃病，以胃黏膜腺体丧失为特征，常伴有纤维化、肠上皮化生和假幽门腺化生。藏药安智精华散（Anzhi Jinghua San，AZJHS）是治疗CAG的代表性藏药复方，由石榴（Punica granatum L.）、肉桂（Cinnamomum cassia Presl.）、白豆蔻（Amomum kravanh Pierre ex Gagnep.）、荜茇（Piper longum L.）和藏红花（Crocus sativus L.）五味药材组成。尽管临床疗效确切，但其具体分子机制尚不清楚。研究人员采用血清药物化学、网络药理学、蛋白质组学、代谢组学及分子生物学方法，结合体内外实验，系统阐明了AZJHS治疗CAG的分子机制。结果显示，AZJHS可改善CAG大鼠血清胃功能标志物（胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ、胃泌素-17），降低炎症细胞因子（肿瘤坏死因子-α、白介素-6）水平，减轻胃黏膜组织病理学和超微结构损伤，抑制细胞凋亡并促进细胞增殖。多组学整合分析表明，NOD样受体（NOD-like receptor，NLR）信号通路是AZJHS调控CAG的关键通路，Bcl-2被鉴定为该通路中的核心靶点。代谢组学揭示CAG大鼠胃黏膜存在甘油磷脂代谢紊乱，溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LysoPC）水平显著升高，其中LysoPC 18:1与Bcl-2表达呈最强负相关。通过分子对接、表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）、微量热泳动（microscale thermophoresis，MST）和细胞热位移分析（cellular thermal shift assay，CETSA），研究人员证实芹菜素（apigenin）是AZJHS中直接结合Bcl-2的吸收成分。体外实验表明，芹菜素可逆转LysoPC 18:1诱导的Bcl-2下调，抑制NLRP1/Caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡及Bax/Caspase-9/Caspase-3介导的线粒体凋亡。综上，AZJHS通过恢复甘油磷脂稳态、降低LysoPC水平、上调Bcl-2表达，从而抑制NLRP1介导的细胞焦亡和线粒体凋亡，发挥对CAG的治疗作用。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是一种以胃黏膜固有腺体减少为病理特征的慢性炎症性胃病，常伴随纤维化、肠上皮化生和假幽门腺化生等组织学改变。流行病学数据显示，我国慢性胃炎的内镜检出率接近90%，其中CAG经内镜诊断约占17.7%，经组织病理学确诊约占25.8%。CAG的发病机制复杂，涉及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染、免疫失调、氧化应激、胃十二指肠反流、遗传易感性和脑-肠轴功能紊乱等多重因素。当前西医治疗策略主要集中于根除幽门螺杆菌、抑制胃酸分泌和胃黏膜保护，但缺乏特异性有效药物，且不良反应发生率和复发率较高。
藏药安智精华散（Anzhi Jinghua San，AZJHS）是治疗CAG的代表性藏药复方，收录于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》（第一册，1995年版），由石榴皮、肉桂、白豆蔻、荜茇和藏红花五味药材组成，具有温胃、消食、化积、除湿的功效。临床研究已证实AZJHS可有效缓解CAG相关症状，但其具体分子机制尚不清楚。近年来研究表明，CAG的进展与细胞凋亡和炎症小体活化的相互作用密切相关，Bcl-2是这一交叉调控网络中的关键节点。Bcl-2除经典的线粒体抗凋亡功能外，还能直接结合NLRP1并抑制其炎症小体活化。同时，慢性炎症状态下甘油磷脂代谢常发生紊乱，导致促炎性溶血磷脂过度蓄积，其中溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LysoPC）被报道可下调Bcl-2表达。然而，这些过程在CAG中是否相互关联，以及AZJHS是否通过调控潜在的LysoPC-Bcl-2-NLRP1轴和线粒体凋亡发挥治疗作用，此前尚不清楚。为此，研究人员开展了本项多组学整合研究。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员采用综合策略开展研究，主要技术方法包括：（1）血清药物化学分析：利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）鉴定AZJHS灌胃后进入大鼠血清的吸收成分；（2）网络药理学分析：利用TCMSP数据库和SwissTargetPrediction工具预测吸收成分的潜在靶点，结合GeneCards、OMIM和DrugBank数据库获取CAG疾病靶点，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并进行GO和KEGG富集分析；（3）4D-DIA定量蛋白质组学：对大鼠胃黏膜组织进行蛋白质组学分析，筛选差异表达蛋白（DEPs）；（4）非靶向代谢组学：采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q-Exactive HF-X）对胃黏膜组织进行代谢组学分析；（5）分子对接、表面等离子体共振（SPR）、微量热泳动（MST）和细胞热位移分析（CETSA）：验证吸收成分与靶蛋白的直接结合；（6）体内外实验验证：采用SD大鼠CAG模型和GES-1人胃黏膜上皮细胞系进行功能验证。动物实验所用SD大鼠（n=58，200±20 g）购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验方案经中国科学院西北高原生物研究所动物实验伦理委员会批准（批准号：NWIPB2023-19）。
三、研究结果
3.1 AZJHS改善CAG大鼠血清胃功能标志物并降低炎症细胞因子
与对照组相比，CAG模型组大鼠血清胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）和胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）水平显著降低，胃泌素-17（GAS-17）水平显著升高，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）水平显著升高。AZJHS低剂量（180.0 mg/kg/day）、高剂量（360.0 mg/kg/day）及阳性对照维酶素胶囊（WMS，216.0 mg/kg/day）治疗均可显著升高PGⅠ水平，降低GAS-17、TNF-α和IL-6水平。
3.2 AZJHS减轻CAG大鼠胃黏膜组织病理学损伤
苏木精-伊红（H&E）染色显示，CAG模型组大鼠胃黏膜出现局灶性糜烂、腺体萎缩和缺失、纤维结缔组织替代、轻度炎症细胞浸润、腺体扩张伴扁平上皮及明显上皮脱落。AZJHS各剂量组和WMS组治疗后，上述组织病理学改变均得到显著改善。
3.3 AZJHS改善CAG大鼠胃黏膜超微结构损伤
透射电子显微镜（TEM）观察显示，CAG模型组大鼠胃黏膜出现质膜模糊、染色质浓缩、线粒体肿胀伴嵴断裂和基质稀疏、细胞内分泌小管分散等超微结构损伤。AZJHS和WMS治疗后，上述异常显著改善，仅见轻微线粒体肿胀和部分嵴断裂，分泌小管数量恢复，质膜基本完整。
3.4 AZJHS抑制CAG大鼠胃黏膜细胞凋亡并促进细胞增殖
TUNEL染色显示，CAG模型组大鼠胃黏膜TUNEL阳性细胞显著增加，AZJHS和WMS治疗显著降低凋亡指数至接近对照组水平。Ki-67免疫荧光染色显示，CAG组Ki-67阳性细胞稀疏，AZJHS和WMS给药后显著增加，表明AZJHS可抑制凋亡并促进胃黏膜细胞增殖。
3.5 鉴定AZJHS大鼠血清吸收成分
UPLC-Q-TOF/MS分析共从AZJHS提取物中检测到436种化合物，通过比较提取物、CAG血清和AZJHS给药血清，最终鉴定出15种吸收成分：2-乙酰基麦角甾苷、宝藿苷Ⅱ、黄芩苷、毕枯枯林、2-羟基苯乙酸、毛蕊异黄酮、伏尔加林、3,4,5-三甲氧基肉桂酸甲酯、莪术二酮、丙烯基愈创木酚、细胞松弛素B、芹菜素、莲心碱、山楂酸和荜茇明宁碱。
3.6 网络药理学鉴定AZJHS抗CAG的核心靶点和通路
构建了15种吸收成分的“成分-靶点”网络，共获得524个潜在靶点。从GeneCards、OMIM和DrugBank数据库检索到1214个CAG疾病靶点，取交集获得136个共同靶点。PPI网络分析显示核心靶点包括TNF、AKT1、BCL2、JUN、EGFR、STAT3、MMP9和SRC。KEGG富集分析显示主要富集于TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、NOD样受体信号通路及胃癌通路。
3.7 蛋白质组学与网络药理学汇聚于NOD样受体信号通路并鉴定Bcl-2为重叠靶点
4D-DIA蛋白质组学分析显示，与对照组相比，CAG组共有1012个DEPs（517个上调，495个下调）；与CAG组相比，AZJHS组有282个上调蛋白和621个下调蛋白。多组比较获得202个显著DEPs，KEGG富集分析显示其富集于TNF信号通路和NOD样受体信号通路。蛋白质组学与网络药理学在NOD样受体信号通路内的交集分析鉴定出Bcl-2为重叠靶点。蛋白质组学数据进一步证实，Bcl-2在CAG组显著下调，AZJHS治疗后显著上调。
3.8 AZJHS上调Bcl-2并抑制NLRP1介导的细胞焦亡和线粒体凋亡
Western blot和RT-qPCR分析显示，CAG模型组大鼠胃黏膜中NLRP1、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N、pro-IL-18、pro-IL-1β、Bax、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3的蛋白和mRNA表达均显著升高，而Bcl-2显著降低。AZJHS治疗可显著下调上述升高的蛋白和基因表达，并上调Bcl-2。
3.9 AZJHS改善CAG大鼠甘油磷脂代谢紊乱
非靶向代谢组学分析显示，CAG组与对照组代谢谱明显分离，AZJHS和WMS组与对照组聚类更接近。共鉴定出546个（CAG vs. CON）和583个（AZJHS vs. CAG）差异代谢物，其中449个重叠。KEGG富集分析显示差异代谢物主要富集于嘌呤代谢、胆固醇代谢和甘油磷脂代谢。CAG组中LysoPC 16:1、LysoPC 18:1、LysoPE 16:1、LysoPE 18:1、LysoPS 16:0显著升高，而胆碱甘油磷酸和甘油磷脂酰肌醇显著降低，AZJHS治疗可逆转这些变化。
3.10 甘油磷脂代谢物与Bcl-2的Spearman相关性分析
Spearman相关性分析显示，7种差异甘油磷脂代谢物均与Bcl-2蛋白表达显著相关：胆碱甘油磷酸（ρ=0.87）和甘油磷脂酰肌醇（ρ=0.78）呈正相关，而LysoPC 18:1（ρ=?0.72）、LysoPS 16:0（ρ=?0.71）、LysoPE 18:1（ρ=?0.68）、LysoPE 16:1（ρ=?0.57）和LysoPC 16:1（ρ=?0.56）呈负相关。其中LysoPC 18:1与Bcl-2的负相关性最强。
3.11 鉴定芹菜素为AZJHS中直接结合Bcl-2的成分
分子对接结果显示，15种吸收成分中芹菜素与Bcl-2的结合亲和力最佳（?7.7 kcal/mol）。SPR分析得出解离常数（KD）为1.20×10?5 M，MST分析得出表观KD为9.02×10?6 M，均表明二者存在中等亲和力相互作用。CETSA实验证实芹菜素在41–66°C范围内增强Bcl-2的热稳定性，在66°C时芹菜素处理组的Bcl-2水平显著高于溶剂对照组。
3.12 芹菜素减轻MNNG诱导的GES-1细胞损伤、上调Bcl-2并抑制细胞焦亡和线粒体凋亡
体外实验表明，芹菜素在5、10、20 μM浓度下可显著提高MNNG（N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍）损伤的GES-1人胃黏膜上皮细胞的存活率，降低TNF-α、IL-6、IL-18、IL-1β和乳酸脱氢酶（LDH）水平。Western blot分析显示，芹菜素可逆转MNNG诱导的Bcl-2下调，并抑制NLRP1、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N、pro-IL-18、pro-IL-1β、Bax、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3的表达升高。
3.13 LysoPC 18:1下调Bcl-2并激活GES-1细胞焦亡和凋亡通路，芹菜素可逆转该效应
LysoPC 18:1（40 μM）处理GES-1细胞可显著升高TNF-α、IL-6、IL-18、IL-1β和LDH水平，下调Bcl-2并上调NLRP1、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N、pro-IL-18、pro-IL-1β、Bax、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3的表达。与芹菜素（5、10、20 μM）共孵育可显著逆转LysoPC 18:1诱导的这些改变，表明芹菜素至少部分通过恢复Bcl-2表达来拮抗LysoPC 18:1诱导的细胞损伤。
四、讨论与结论
讨论部分指出，AZJHS的疗效首先得到血清学证据支持：CAG大鼠PGⅠ和PGⅡ显著降低提示胃体萎缩，GAS-17代偿性升高进一步佐证这一结论，AZJHS治疗可逆转上述改变。组织病理学和超微结构分析进一步证实了AZJHS的胃黏膜保护作用，但组织学改善程度不如炎症标志物降低明显，可能因为炎症标志物反映急性可逆反应，而组织学损伤代表累积性结构改变、逆转较慢。TUNEL和Ki-67染色结果表明AZJHS可恢复胃黏膜细胞增殖-凋亡平衡。
多组学整合分析提示NOD样受体信号通路可能是AZJHS调控CAG炎症和细胞死亡的关键通路，Bcl-2被鉴定为该通路中的候选靶点。Bcl-2具有双重保护功能：既通过经典抗凋亡作用抑制线粒体凋亡，又直接结合NLRP1抑制炎症小体组装和活化。CAG胃黏膜中Bcl-2显著下调，可能解除对NLRP1炎症小体的抑制并损害线粒体完整性，导致细胞焦亡性炎症和凋亡性细胞死亡。代谢组学揭示CAG大鼠存在甘油磷脂代谢紊乱，溶血磷脂蓄积与膜磷脂重塑能力下降形成恶性循环。LysoPC 18:1与Bcl-2呈最强负相关，提示其可能是连接脂质紊乱与Bcl-2抑制的潜在桥梁。芹菜素被鉴定为AZJHS中直接结合并稳定Bcl-2的生物活性成分，可拮抗LysoPC 18:1诱导的Bcl-2抑制及下游焦亡和凋亡通路。
研究结论：本项多组学整合分析表明，藏药复方AZJHS通过恢复甘油磷脂稳态、降低LysoPC水平、上调Bcl-2表达来改善CAG。上调的Bcl-2可抑制NLRP1介导的细胞焦亡和线粒体凋亡，从而减轻胃黏膜损伤和炎症。芹菜素被鉴定为AZJHS中直接结合Bcl-2的生物活性成分，可减轻LysoPC诱导的Bcl-2抑制及相关的焦亡和凋亡通路。这些发现为AZJHS治疗CAG提供了基于多组学的药理学依据，并提示靶向“代谢-炎症-细胞死亡”轴可能是藏药研发中一个有前景的策略。
