监管导向下 Siltartoxatug 在食蟹猴中的药代动力学与免疫原性研究：一种抗破伤风毒素的重组天然人单克隆抗体

《Advances in Pharmacological and Pharmaceutical Sciences》：Regulatory-Driven Pharmacokinetic and Immunogenicity Study of Siltartoxatug, a Recombinant Native Human Monoclonal Antibody Against Tetanus Toxin, in Cynomolgus Monkeys

　　

Siltartoxatug——由 Trinomab Pharmaceutical Co., Ltd. 利用其专有 HitmAb? 平台开发——是首创（first-in-class）用于破伤风紧急预防的重组单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）药物，于2025年2月获中国国家药品监督管理局（China National Medical Products Administration, NMPA）批准，解决了替代血源性被动免疫制剂以预防破伤风的关键未满足需求。Siltartoxatug 的非临床药代动力学（pharmacokinetic, PK）和免疫原性研究严格按照全球监管指南设计并实施，以启动首次人体（first-in-human）临床试验。研究人员报告了该研究的综合发现。24只未接触过抗原的食蟹猴（Macaca fascicularis）被随机分配至四组，每组6只。第1组猴子接受静脉（intravenous, IV）输注 Siltartoxatug 1 mg/kg。第2、3、4组猴子接受肌肉注射（intramuscular, IM）Siltartoxatug，剂量分别为1 mg/kg、3 mg/kg 或10 mg/kg。给药后57天内采集血样，并使用经过验证的方法测定血清药物浓度和抗药抗体（anti-drug antibody, ADA）水平。结果显示，IM 给予 Siltartoxatug 表现出良好的 PK 特征：主要全身分布，高生物利用度（1 mg/kg 时为88.0%），低表观分布容积（58.7–69.4 mL/kg），消除半衰期延长（11.7–12.4天），平均达峰时间（time to maximum concentration, T_max）短（1.2–2.7天），剂量依赖性全身暴露且无显著性别差异。此外，观察到极小的 ADA 反应。这些发现为其临床转化提供了更好的可预测性，并为其首次人体开发提供了依据。

论文主体内容解读

破伤风是破伤风梭菌（Clostridium tetani）感染引起的严重致死性疾病。该菌为革兰阳性专性厌氧菌，芽孢经伤口进入，在厌氧条件下萌发并产生破伤风神经毒素（tetanus neurotoxin, TeNT）。TeNT 为150 kDa蛋白，由A、B、C三个功能片段组成，分别介导金属蛋白酶活性、易位和神经元结合。毒素可经淋巴和血液循环全身播散，A片段金属蛋白酶活性抑制神经递质释放，引起肌肉强直和痉挛。中和抗体阻断TeNT功能是破伤风预防的关键效应机制。破伤风类毒素（tetanus toxoid, TT）疫苗可用于主动免疫以获得长期保护；但对疫苗接种史不完整或未记录者，需用预成抗毒素抗体进行被动免疫以快速提供可靠保护。人血源破伤风免疫球蛋白（human tetanus immune globulin, HTIG）是全球最广泛使用的被动免疫制剂，印度和中国仍有马异源免疫球蛋白临床应用。由于马和人血清来源制品存在供应限制和安全风险，高效重组中和单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）可能成为更优替代。

Siltartoxatug 由 Trinomab Pharmaceutical Co., Ltd. 开发，源自专有 HitmAb? 平台从单个血浆B细胞分离的天然人mAb，在中华仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞中以人 IgG₁ 大规模 GMP 条件下生产。其去糖基化完整分子量为144.2 kDa，等电点为9.2。机制为特异性结合 TeNT A和B片段关键氨基酸残基组成的构象表位，阻断 TeNT 易位和金属蛋白酶活性。小鼠体内毒素挑战试验显示其效价为400 IU/mg，而HTIG产品约0.5–1.7 IU/mg。高中和效力和全球缺乏mAb破伤风疗法使其成为潜在首创候选药物。

监管方面，EMA、FDA和NMPA对首创创新药要求全面动物PK和免疫原性研究支持临床开发。核心PK参数如生物利用度、半衰期、清除率和分布容积用于预测人体行为并制定临床试验策略；免疫原性研究揭示抗药抗体（anti-drug antibody, ADA）如何影响PK、疗效和安全性。动物结果不能预测人体免疫原性，但有助于优化临床试验ADA监测策略。ICH和监管机构推荐根据与人的药理学相似性选择动物模型。Siltartoxatug 靶向外源性TeNT而非内源性蛋白，因此无靶点相关药理学相关动物种属；但食蟹猴在进化上更接近人，且人mAb与食蟹猴和人新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor, FcRn）结合亲和力相当，结合排序和pH依赖相互作用高度保守，故选择食蟹猴进行非临床PK研究。

临床需求方面，预防破伤风需循环抗毒素达保护水平。紧急暴露后预防（post-exposure prophylaxis, PEP）需要快速达到保护抗体水平，而非立即最大峰浓度。IM途径比皮下注射系统暴露更快，又避免IV输注不良事件和资源负担。单次IM HTIG已全球成功使用数十年，并被WHO推荐为首选被动破伤风免疫治疗。Siltartoxatug作为重组mAb也提供被动免疫，因此选择单次IM为拟定临床方案。为遵循3R原则减少动物数，仅设一个IV组计算绝对生物利用度；剂量依据小鼠疗效数据和HTIG临床剂量确定。研究目标为：表征单次IM给药后食蟹猴血清PK谱，定量给药后57天血清药物浓度；通过血清ADA评估免疫原性。

关键技术方法方面，研究人员采用24只健康未接触过抗原的食蟹猴，来源于广东春盛生物科技发展有限公司，研究在WuXi AppTec动物设施进行。动物随机分四组，每组6只，每性别3只。第1组IV输注1 mg/kg；第2、3、4组IM注射1、3、10 mg/kg。给药后57天采集血样。PK和ADA均在GLP实验室验证。PK用ELISA，以山羊抗人IgG Fc捕获，HRP标记TBA002-Target检测，后者含TeNT A和B片段并保留构象表位；采用Phoenix WinNonlin 6.3非房室分析。ADA用Meso Scale Discovery平台电化学发光桥联法，生物素化siltartoxatug和钌化siltartoxatug；阳性对照为抗独特型多克隆抗体；验证包括SCPF和CCP等。

研究结果按原文小标题概括如下。临床观察显示，所有动物在研究期间均耐受各剂量siltartoxatug，未观察到不良反应。PK测定方法验证中，共17个分析批，所有批和验证样品符合接受标准。校准范围10.0–1000 ng/mL，LLOQ 10.0、LQC 25.0、MQC 110、HQC 750、ULOQ 1000 ng/mL。批内准确度偏倚?11.5%–15.2%，精密度CV 0.6%–12.1%；批间偏倚?7.3%–8.0%，精密度CV 3.6%–9.3%；总误差8.8%–15.5%。方法对猴血清siltartoxatug特异，无基质效应包括溶血干扰；稳健；浓度高达300,000 ng/mL无钩状效应；稀释因子验证至15,000；7次冻融、室温或2–8°C 24 h、≤?60°C 90天稳定；平行性验证。结论为PK assay成功验证用于食蟹猴血清siltartoxatug浓度测定。ADA测定方法验证中，浮动SCPF为1.23，CCP为19%。方法在不同孵育时间、试剂批号、板振荡器、分析人员和分析日等条件下表现稳健。方法灵敏度为16.115 ng/mL阳性对照抗体。阳性对照抗体浓度高达40,000 ng/mL无钩状效应。所有血清批包括溶血血清通过选择性评价。筛选批内CV 2.4%–13.7%，批间6.7%–13.2%；确认批内0.4%–5.0%，批间0.9%–5.7%。药物耐受：ADA 2000 ng/mL时耐受700 μg/mL siltartoxatug；1000 ng/mL时400 μg/mL；500 ng/mL时350 μg/mL；97 ng/mL时125 μg/mL。稳定性为7次冻融、2–8°C或室温24 h、≤?60°C 3个月。结论为ADA assay成功验证用于食蟹猴抗siltartoxatug抗体测定。血清PK结果显示，IV后血清浓度立即达峰，短暂明显下降，随后缓慢下降；IM后血清浓度快速升高，2–96 h达峰，随后缓慢下降。任何剂量组C_max或AUC_0-last均无显著性别差异，故用性别合并数据计算PK参数。1 mg/kg IM绝对生物利用度为88.0%。三个IM剂量（1、3、10 mg/kg）剂量归一化C_max和AUC_0-last比值分别为1:0.99:1.18和1:0.93:1.02，显示线性剂量比例全身暴露。T_max随IM剂量增加有缩短趋势，且各IM组个体变异明显。V_dss（IV）或V_z/F（IM）为56.0–69.4 mL/kg，CL（IV）或CL/F（IM）为0.1404–0.1752 mL/h/kg，t_1/2为281–319 h（11.7–13.3天），表明进入体循环后IV和IM系统分布与消除可比且在各IM剂量间一致。ADA结果显示，24只动物中3只ADA阳性：第2组1/6（C2503，1 mg/kg），第4组2/6（C4002和C4501，10 mg/kg）。ADA滴度2–73。

讨论部分总结如下。研究人员指出，mAb药物生物分析需注意分析物为“总药”还是“游离药”。siltartoxatug靶点为外源TeNT，猴血清无内源存在，因此血清中所有siltartoxatug均处于未结合、游离且有药理活性状态，ELISA直接定量游离siltartoxatug，同时提供总siltartoxatug浓度。ADA假阴性可由过高药物浓度引起，因此方法验证必须评估药物耐受。ADA验证显示97 ng/mL阳性对照可耐受125 μg/mL siltartoxatug，高于所有动物自168 h起最高血清siltartoxatug浓度116 μg/mL，表明低至97 ng/mL的阳性对照不会产生假阴性。FDA推荐最低灵敏度100 ng/mL，证实ADA assay合格。中高IM剂量未直接测绝对生物利用度因无对应IV数据，但低剂量88.0%生物利用度和所有IM剂量线性剂量比例暴露强烈提示更高剂量吸收同样广泛。IM 1 mg/kg后1 h即可达5.6±2.3 μg/mL，证实早期系统吸收。T_max个体变异大，因mAb IM吸收主要经淋巴系统，引流动力学个体差异大；但暴露幅度相关终点控制较好。T_max随剂量增加而降低，提示高剂量吸收更快，但不影响剂量比例。总体IM吸收具高生物利用度和快速起效，剂量优化后可能使受试者迅速达保护浓度。IM后V_z/F符合mAb预期，且<0.07 L/kg，提示药物主要限于血管腔，有利于维持全身治疗浓度，但需临床确认。FcRn结合是IgG PK关键。siltartoxatug与人FcRn结合解离常数约pH 6.0为100 nM，pH 7.4为10 μM（未发表数据），与非Fc工程化人mAb相当。清除和t_1/2落在野生型人IgG在食蟹猴的已知范围。多数治疗mAb有靶点介导药物处置（target-mediated drug disposition, TMDD）非线性清除，加速消除缩短半衰期；siltartoxatug无内源药理靶点，无TMDD，故低清除和持续半衰期。小鼠IM 0.05–5 mg/kg短期PK（未发表）也显示剂量比例。跨物种宽剂量线性支持可靠外推，有助于首次人体起始剂量和剂量递增。破伤风潜伏期平均约8天，1–21天；远离中枢神经损伤潜伏期较长，短潜伏期更严重死亡风险高。因此快速达有效血清浓度/滴度和维持水平均重要。1 mg/kg IM后1 h，siltartoxatug血清浓度折合2.24 IU/mL（基于小鼠毒素挑战效价），为跨物种保护水平0.01 IU/mL的224倍。HTIG临床研究中IM后1、2、3、7、14天平均滴度分别为0.010、0.017、0.022、0.032、0.014 IU/mL；另一研究仅83%受试者1天后>0.01 IU/mL。1 mg/kg给药后1344 h（57天）siltartoxatug血清浓度约0.6 μg/mL，折合0.24 IU/mL，仍远高于保护阈值。单次HTIG通常含约150–500 mg蛋白，相当于60 kg个体约2.5–8 mg/kg外源血蛋白。IM siltartoxatug以显著更低外源蛋白负担快速达有效水平并长期维持，提示可能比HTIG更快、更持久、更安全。ADA方面，重组天然人mAb在猴中ADA低甚至低于检测限。动物ADA不预测人ADA，但全人源支持人免疫原性低。临床试验验证ADA发生率低至4.0%，滴度1.0–26.3（未发表）。研究结论翻译：总之，siltartoxatug在食蟹猴中表现出良好PK特征，关键特征包括快速达到保护药物水平、延长有效暴露、线性药代动力学和极小ADA反应。这些良好药理性质源于其独特分子设计。这些发现为其临床阶段开发提供更好的可预测性并提示有希望的临床结果。同时，非临床PK和免疫原性数据满足启动首次人体试验的关键全球监管要求。在此基础上，siltartoxatug的IND申请于2021年获美国FDA和中国NMPA批准，在积极III期试验结果后于2023年获NMPA上市批准。