《Journal of Food Composition and Analysis》：Integrated suspect screening and non-targeted metabolomic profiling of extractable compounds in Southern Italian and Spanish beans by UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS combined with chemometric analysis
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本研究采用超高效液相色谱-四极杆-Orbitrap高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS）结合QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe）前处理方法，对来自南意大
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本研究采用超高效液相色谱-四极杆-Orbitrap高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS）结合QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe）前处理方法，对来自南意大利（n = 23）和西班牙（n = 21）的干燥菜豆（Phaseolus vulgaris L.）样品开展综合可疑筛查与非靶向代谢组学分析。可疑筛查基于约9,800条目的内部数据库进行，共获得53个推定鉴定化合物，涵盖五大化学类别，其中农药占49.1%，药物占28.3%，真菌毒素及真菌代谢物占11.3%，植物特有代谢物占7.5%，工业污染物占3.8%。通过参考标准品比对，17个候选物中有11个获得确认（Level 1），包括9种农药、1种农药增效剂（增效醚，piperonyl butoxide）和1种真菌毒素（细交链孢菌毒素，tentoxin）。半定量估算显示，3种欧盟未批准物质（氟环唑、三唑醇、噻虫嗪）的估计浓度高于默认最大残留限量（MRL）10 μg/kg。非靶向代谢组学分析共获得471个可提取特征，主成分分析（PCA）显示仅存在部分地理来源聚类趋势，而正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显著改善了组间分离，模型参数为R2Y = 0.849、Q2 = 0.712，受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.944，外部验证集正确分类率（CCR）达91.7%。置换检验（n = 100）确认模型未出现过拟合。基于变量重要性投影（VIP）≥ 1、p ≤ 0.05及|Log?FC| ≥ 0.1的标准筛选出若干判别特征，包括葫芦巴碱、11E-十四碳烯-1-醇、2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇等推定注释化合物。本研究展示了整合可疑筛查与非靶向代谢组学策略在豆类食品安全评估和地理来源鉴别中的互补价值。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
菜豆（Phaseolus vulgaris L.）是全球消费最广泛的豆类作物之一，也是地中海地区传统膳食的基本组成部分。豆类的化学组成受地理来源、农业实践和环境条件等多重因素影响，同时豆类在种植、采后处理、加工和储存过程中可能接触多种外源性化合物，包括农药残留、真菌毒素、药物化合物以及与包装材料或环境来源相关的物质。许多这类物质未被常规监测或专门监管，其潜在共存可能导致多组分暴露场景，传统靶向分析方法难以全面评估。传统靶向分析方法虽具有高灵敏度和与监管监测要求的良好契合性，但受限于预定义的分析物列表，可能遗漏意外污染物、转化产物或新兴物质。因此，需要能够超越常规靶向分析的分析流程，特别是用于食品基质中农药残留的追溯性和数据库辅助调查。
基于上述考虑，本研究针对南意大利和西班牙两个地中海国家干燥菜豆样品，开展整合可疑筛查与非靶向代谢组学分析的比较研究。这两个国家被选为研究对象，是因为菜豆分别是其膳食的重要组成部分，而品种、农业实践和供应链的差异可能影响其化学特征。现有信息往往分散或来自缺乏统一国家间比较的广泛调查，这一空白凸显了需要能够捕捉细微组成差异、同时评估与食品真实性和可追溯性相关的地理模式的综合分析策略。
二、研究内容与主要结论
本研究应用整合的UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS工作流程，对南意大利（n = 23）和西班牙（n = 21）共44份干燥菜豆样品进行分析，采用QuEChERS提取方法。首先应用可疑筛查策略调查广泛化学污染物的存在，包括农药、兽药和药物残留、真菌毒素及新兴化合物；随后利用同一数据集进行非靶向代谢组学分析，以表征已知污染物之外的可提取特征；最后使用多元化学计量学工具评估与地理来源相关的组成差异，并识别南意大利与西班牙样品之间的推定判别化合物。
可疑筛查在44份样品中的37份（84.1%）中获得了53个推定鉴定，涵盖五大化学类别，农药类占主导（49.1%），其次为药物类（28.3%）。通过参考标准品确认了11个化合物，其中3种非批准物质的估计浓度高于默认欧盟MRL。非靶向代谢组学分析结合OPLS-DA监督建模实现了良好的地理来源判别，外部验证正确分类率达91.7%。本研究展示了整合可疑筛查与非靶向代谢组学策略在豆类食品安全评估和地理来源鉴别中的互补价值，为食品真实性和可追溯性研究提供了方法学参考。
三、关键方法技术概述
本研究采用的主要关键技术方法包括：第一，改良QuEChERS提取流程，结合PSA和C18分散固相萃取净化（d-SPE），适用于干燥豆类基质的多残留分析；第二，UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS分析平台，采用数据非依赖采集（DIA）策略，正负离子模式全扫描，分辨率35,000 FWHM，质量精度≤5 ppm；第三，基于约9,800条目内部数据库的可疑筛查工作流程，要求至少两个诊断碎片离子、母离子质量偏差≤5 ppm、碎片离子≤10 ppm，鉴定置信度按Schymanski分级系统划分；第四，Compound Discoverer?非靶向代谢组学数据处理流程，包括特征检测、保留时间对齐、背景过滤和注释；第五，SIMCA?多元化学计量学分析，包括PCA无监督探索、PLS-DA和OPLS-DA监督建模、置换检验（n = 100）和外部验证集评估。样本队列包括南意大利23份和西班牙21份干燥菜豆样品，涵盖多种品种、常规和有机农业实践以及PDO/PGI认证产品。
四、研究结果
4.1 可疑筛查分析结果
可疑筛查共获得53个推定鉴定，涵盖五大化学类别，其中农药占49.1%，药物占28.3%，真菌毒素及真菌代谢物占11.3%，植物特有代谢物占7.5%，工业污染物占3.8%。阳性样品中56.8%来自南意大利，43.2%来自西班牙，但该比例仅为描述性统计，不视为来源相关分布模式。农药类中杀虫剂为最大亚类（38.5%），其次为除草剂（26.9%）、杀菌剂（23.1%）和植物生长调节剂（11.5%）。药物类中中枢神经系统药物占26.7%，心血管药物占20.0%，抗组胺和呼吸系统药物占20.0%，抗炎药物占13.3%。真菌毒素中roquefortine C和meleagrin最为常见，各在3份样品中检出。植物特有代谢物中jervine最为常见，在4份样品中检出。工业污染物（二氨基甲苯和邻苯二甲酸丁苄酯）仅在3份西班牙样品中零星检出。阳性样品中32.4%含单一推定鉴定，43.2%含2-3个化合物，24.3%含超过3个推定鉴定，表明单个样品中多种可疑筛查分配频繁共存。
4.2 确认与半定量评估结果
对17个具有参考标准品的候选物进行标准品确认，其中11个获得Level 1确认，包括9种农药（氟环唑、吡虫啉、啶酰菌胺、戊菌唑、三唑醇、噻虫胺、噻虫嗪、嘧菌酯、烯草酮亚砜）、农药增效剂增效醚和真菌毒素tentoxin。6个初始Level 2推定鉴定（异稻瘟净、异丙威、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、交链孢酚单甲醚、醚菊酯、乙螨唑）因保留时间与参考标准品不一致而被判定为假阳性，表明仅凭精确质量和碎片离子证据不足以提供确定性结构确认。半定量估算显示，已批准物质的确认残留均低于各自MRL，而氟环唑、三唑醇和噻虫嗪的估计浓度高于非批准物质默认MRL（10 μg/kg）。烯草酮亚砜在已批准残留中显示最高估计浓度（494.4 μg/kg），但该值不应解释为烯草酮相关化合物的总残留水平。tentoxin在1份南意大利样品中检出（5.16 μg/kg），属于目前未对干燥豆类商品设定MRL的新兴真菌代谢物。
4.3 化学计量学分析结果
PCA分析显示PC1解释63.0%总方差，PC2解释11.1%，仅显示部分地理来源聚类趋势，两组间存在显著重叠。PLS-DA模型（R2Y = 0.501，Q2 = 0.452，AUC = 0.840）仅提供中等分离效果，外部验证CCR为75%，意大利样品正确分类率仅58.3%。OPLS-DA模型（一个预测成分和九个正交成分）显著改善了判别性能，R2Y = 0.849，Q2 = 0.712，AUC = 0.944，外部验证CCR达91.7%，仅1份意大利和1份西班牙样品被误分类。置换检验R2和Q2截距值分别为0.340和?0.613，Q2负截距表明置换模型缺乏预测能力，未显示明显过拟合。
4.4 判别特征推定注释结果
基于VIP ≥ 1、p ≤ 0.05和|Log?FC| ≥ 0.1标准筛选出若干判别特征，包括葫芦巴碱（VIP = 2.39，p = 2.5 × 10??，内源性生物碱）、11E-十四碳烯-1-醇（VIP = 2.03，p = 8.8 × 10??，外源性长链脂肪醇）和2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇（VIP = 2.54，p = 1.5 × 10??，外源性化合物）等。所有注释均为Schymanski Level 4（分子式水平），所列化合物名称代表推定数据库候选物而非确认结构，提出的内源或外源来源应视为解释性假设。
五、讨论与结论
讨论部分指出，农药残留的主导地位与豆类作物种植中广泛使用植保措施一致。药物类化合物的检出支持了农业系统暴露于受污染灌溉水、废水回用或土壤改良剂的先前观察。真菌毒素的检出与豆类采后处理或储存过程中在不当环境条件下的真菌污染相关。非批准新烟碱类杀虫剂（噻虫嗪、噻虫胺）的检出值得关注，因其在土壤-植物系统中具有良好记录的持久性和迁移性，可能源于历史应用的残留或环境再分配过程。OPLS-DA模型在包含品种、农业实践、认证方案、采购渠道和区域覆盖等多样性的样品集中仍能实现地理来源判别，表明该异质性未妨碍对两个预定地理来源组的判别。
研究结论表明，整合UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS可疑筛查与非靶向代谢组学分析的工作流程能够提供化学污染和组成变异的互补信息。可疑筛查确认了11个化合物，其中3种非批准物质的估计浓度高于默认EU MRL，提示需要持续关注非批准物质的残留情况。非靶向代谢组学结合OPLS-DA分析实现了南意大利与西班牙豆类样品的良好判别，外部验证CCR达91.7%，展示了该方法在地理来源鉴别和食品真实性评估中的潜力。本研究为豆类食品安全评估和地理来源追溯提供了整合分析策略的方法学参考。
