哥斯达黎加都市区新鲜农产品中隐孢子虫（Cryptosporidium sp.）污染情况更新：分子检测与粪便污染指标评估

《Journal of Food Protection》：Occurrence of Cryptosporidium sp. in fresh produce from the Metropolitan Area of Costa Rica: an update

　　

食品安全是一项重要的全球公共卫生议题。水果和蔬菜被认为是细菌、病毒、真菌和寄生虫（包括隐孢子虫（Cryptosporidium sp.））等传染性病原体的主要传播媒介。为评估哥斯达黎加都市区市售草莓（Fragaria spp.）、生菜（Lactuca sativa）和香菜（Coriandrum sativum）中隐孢子虫的存在情况及其粪便污染程度，研究人员采集了96份样本，采用寄生虫学方法（湿片镜检和改良齐尔-尼尔森染色（modified Ziehl-Neelsen stain））和分子生物学方法（巢式PCR（nested PCR））扩增隐孢子虫gp60基因，并通过培养法和菌落计数检测总大肠菌群、耐热大肠菌群及大肠杆菌（Escherichia coli），进一步使用VITEK系统进行鉴定。湿片镜检和改良齐尔-尼尔森染色结果显示，显微镜下隐孢子虫阳性样本为5份；聚合酶链反应（PCR）阳性样本为22份，鉴定物种为微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）。香菜样本的总大肠菌群和耐热大肠菌群计数最高，且在82份进行细菌学分析的样本中，有14份检出大肠杆菌。在哥斯达黎加不同省份的生鲜果蔬中检出微小隐孢子虫，尤其是通过分子技术检出，表明有必要加强这些食品生产和销售环节的监测与控制，以完善风险评估并保障公共卫生。

**论文解读：哥斯达黎加都市区新鲜农产品中隐孢子虫污染状况与粪便污染指标评估**

**一、研究背景与目的**
食用农产品是人体获取营养的重要来源，但其安全性直接关系到公众健康。新鲜果蔬在种植、采收、加工和销售过程中，可能因灌溉用水不洁、粪便施肥、手工处理不当等原因，被细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体污染，从而成为食源性疾病的传播媒介。隐孢子虫是一种在全球范围内广泛分布的原生动物寄生虫，其卵囊耐受性极强，可在环境中长期存活，且感染剂量极低（摄入1至30个卵囊即可导致感染）。该寄生虫是导致全球腹泻病的主要原因之一，尤其对免疫功能低下人群可造成慢性、危及生命的感染。在已知的48余种隐孢子虫中，微小隐孢子虫和人源隐孢子虫（C. hominis）占全球人类感染的90%以上。尽管隐孢子虫已被认定为重要的食源性寄生虫，但在美国和欧盟的新鲜农产品监管微生物标准中并未被纳入，其流行病学监测主要依赖风险评估，常规检测仅在暴发疑似或流行病学研究中进行。目前虽有用于新鲜绿叶蔬菜和浆果中隐孢子虫和贾第虫检测的标准化方法（ISO 18744:2016），但其在灵敏度、回收效率和活性评估方面存在局限，且不包括分子分析，无法进行物种或基因型鉴定。为此，本研究旨在评估哥斯达黎加都市区市售草莓、生菜和香菜中隐孢子虫的污染情况，同时通过检测总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠杆菌评估粪便污染程度，探讨细菌学指标与寄生虫污染之间可能存在的关联。

**二、研究设计与技术方法**
本研究于2023年3月至2024年2月期间，从哥斯达黎加都市区（阿拉胡埃拉、卡塔戈、埃雷迪亚和圣何塞四省）的市政市场和农贸市场采集了32份草莓、32份生菜和32份香菜样本。在研究正式开始前，研究人员进行了人工接种微小隐孢子虫卵囊的预实验，以评估所选用样本处理与回收方法对三种食品基质的适用性。样本经磷酸盐缓冲液（PBS）洗脱、震荡和纱布过滤后，采用Sheather’s和Ritchie浓缩法处理，湿片镜检和改良齐尔-尼尔森染色进行形态学鉴定。DNA提取采用酚-氯仿-异戊醇法，并利用巢式PCR扩增gp60基因（约400 bp片段），扩增产物经Sanger测序后，使用MEGA 12.0软件进行序列比对和最大似然系统发育分析。细菌学分析方面，采用紫红胆汁琼脂（VRBA）平板计数法检测总大肠菌群和耐热大肠菌群，可疑大肠杆菌样菌落经Levine琼脂和胰酪大豆琼脂（TSA）纯化后，使用VITEK 2 COMPACT系统进行菌种鉴定和抗生素敏感性检测；同时采用含新生霉素的胰酪大豆肉汤（TSB）富集和山梨醇麦康凯琼脂筛选大肠杆菌O157:H7。细菌学分析共在96份样本中的82份中进行。

**三、主要研究结果**

**（一）显微镜检与巢式PCR检测隐孢子虫的结果**
湿片镜检和改良齐尔-尼尔森染色显示，仅5份样本（3份生菜、1份草莓、1份香菜）镜检阳性（5.2%）。巢式PCR检测则显示22份样本阳性（22.9%），其中草莓阳性率最高（15/32，46.9%），其次为香菜（4/32，12.5%）和生菜（3/32，9.4%）。两种方法的一致性分析显示kappa系数为0.231（p<0.05），一致性程度为“轻微至可接受”，表明分子方法的检出能力显著高于形态学方法。所有PCR阳性样本经测序和系统发育分析，均被鉴定为微小隐孢子虫，且其gp60序列与GenBank中微小隐孢子虫IIc亚型家族聚为一支，该亚型以人类适应型传播为主。序列已提交至GenBank，入库编号为PZ444063至PZ444083。

**（二）总大肠菌群、耐热大肠菌群及大肠杆菌的检测结果**
在三种食品中，香菜样本的总大肠菌群计数最高，草莓最低；耐热大肠菌群计数同样以香菜为最高（7份样本范围在1.0×10⁵至1.0×10⁷ CFU/g），草莓仅一份样本检出250 CFU/g，生菜介于1.0×10²至1.0×10⁶ CFU/g之间。在82份细菌学分析样本中，经VITEK系统鉴定，22份疑似大肠杆菌分离物中有8份被确认为大肠杆菌，其余为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、植生拉乌尔菌（Raoultella planticola）等其他肠杆菌科细菌。经新生霉素富集和山梨醇麦康凯琼脂筛选的17份山梨醇阴性分离物中，8份被鉴定为大肠杆菌，但无一为大肠杆菌O157:H7。两个分析路径均检出大肠杆菌的重叠样本为2份，故大肠杆菌实际检出样本数为14份（14/82，17.1%）。此外，在抗生素敏感性测试中检出了对头孢唑林耐药的肠杆菌科细菌。

**四、研究讨论与结论**
本研究发现，利用高灵敏度的分子检测方法，草莓中微小隐孢子虫的阳性检出率（46.9%）显著高于国际上针对浆果报道的0%至8%的流行率范围，这可能与传统检测方法在浆果类复杂基质中卵囊回收效率较低导致污染水平被低估有关。所有阳性样本均鉴定为微小隐孢子虫，且其gp60序列属于IIc亚型家族，该亚型与人类适应型传播模式相关，提示污染可能来源于含人类粪便的污水或废水灌溉，及生产链中的人为操作环节。这与哥斯达黎加中央谷地园艺系统此前发现的微生物污染风险因素（如使用含动物粪便的有机肥、使用河水或灌溉渠水、田间人员卫生设施缺乏等）相一致。研究同时表明，细菌学指标（总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌）与隐孢子虫的存在之间并无稳定的关联，这符合粪便指示菌不能在所有情况下作为隐孢子虫污染良好预测因子的观点。大肠杆菌O157:H7的未检出降低了由该血清型引发腹泻暴发的风险，但对头孢唑林耐药的肠杆菌科细菌的存在提示环境中存在抗生素选择性压力，需引起抗菌药物耐药性监测方面的关注。本研究检测到生鲜农产品中微小隐孢子虫，特别是通过高度灵敏的分子技术实现，表明有必要加强哥斯达黎加这类食品生产和销售环节的监测与控制，以改进风险评估，保障公共卫生安全。