商业烟熏三文鱼中多种 Listeria monocytogenes 菌株生长变异性：挑战试验与预测微生物学工具比较

《Journal of Food Protection》：Characterization of the growth variability of multiple Listeria monocytogenes strains on smoked salmon

　　

Listeria monocytogenes 在即食（ready-to-eat, RTE）产品如烟熏三文鱼中构成显著食品安全风险，该类产品在冷藏贮存期间支持细菌生长，并已与多起李斯特菌病暴发相关。产品制造商依赖挑战试验和预测微生物学（predictive microbiology, PM）确保产品安全，而菌株变异性是这两种方法的重要考虑因素。在本研究中，研究人员报道了挑战试验中菌株变异性的详细分析，并将结果与常用 PM 工具的输出进行比较。研究人员在商业烟熏三文鱼产品上，于冷藏（4.1°C）、温度滥用（9.6°C）和室温（19.8°C）条件下，用九株单独的 L. monocytogenes 菌株生成了详细生长数据。菌株基于谱系、菌株来源、实验室培养基中耐冷/耐盐差异进行选择，并包括欧盟 L. monocytogenes 参考实验室（European Union Reference Laboratory for L. monocytogenes, EURL-Lm）技术指导文件中推荐的菌株。生长速率与成熟 PM 工具（ComBase、Food Spoilage and Safety Predictor, FSSP、Pathogen Modeling Program, PMP）以及烟熏三文鱼特异性二级模型的预测进行比较。在 9.6°C 和 19.8°C 下，所有菌株的生长速率均低于三级模型预测，但在 4.1°C 下部分菌株的估计生长速率高于预测速率。聚类分析还表明，生长速率与菌株来源或耐盐/耐冷性之间无显著相关性，尽管来自谱系 II 的菌株在 4.1°C 和 19.8°C 下明显与较高生长速率相关。总体而言，本研究展示了遗传多样性 L. monocytogenes 菌株在烟熏三文鱼产品上的详细菌株特异性生长速率数据，并强调在设计挑战试验和解释预测微生物学输出时考虑菌株变异性的重要性。

研究背景与目的：Listeria monocytogenes 是嗜冷、兼性厌氧菌，常见于土壤、植物、水、奶以及人和动物粪便中，是李斯特菌病病原，对免疫受损个体、婴儿、老年人和孕妇威胁较大。欧洲疾病预防控制中心报告，L. monocytogenes 在欧盟食源感染中造成的住院和死亡比例最高。冷熏和温熏三文鱼因通常不进一步烹饪，且 pH 约 6.0–6.2、水分活度（a_w）0.96–0.99，允许该病原在冷藏期间生长；欧盟基线调查曾在零售冷熏鱼中检出 17.4% 的 L. monocytogenes，冷熏三文鱼还与克隆复合体 8 跨境暴发及丹麦、德国和意大利与烟熏三文鱼产品相关的 ST1607 持续暴发有关，后者导致 5 例死亡。食品企业依赖挑战试验支持产品微生物安全，PM 工具如 ComBase、PMP 和 FSSP 被用于危害分析与关键控制点（HACCP）、定量微生物风险评估（QMRA）和食品安全目标（FSO）评估。EURL-Lm 指南推荐菌株和菌株混合物以考虑菌株生长变异性，但推荐菌株主要基于肉汤培养基性能；Guillier et al. 强调仅基于肉汤性能选择菌株可能不能准确预测其在食品基质中的行为。已有研究报道单株或菌株混合物在烟熏三文鱼上的生长，但此前未报道一组遗传多样 L. monocytogenes 菌株在烟熏三文鱼上生长动力学的变异性，也未比较多个菌株生长速率数据与广泛使用 PM 工具的预测，或评估这种变异性是否可由谱系或来源预测。研究人员所在实验室拥有大型多样环境与临床 L. monocytogenes 菌株库，Wu et al. 和 Myintzaw et al. 已对其进行遗传和生理表征。研究目的为：量化九株 L. monocytogenes 在商业即食烟熏三文鱼挑战试验中的生长动力学变异性；将结果与广泛使用 PM 工具预测比较；确定先前定义的菌株特征（谱系、分离来源、实验室 pH、冷和盐耐受表型）是否与挑战试验生长行为相关。

方法概括：研究人员从 Munster Technological University（MTU, Cork, Ireland）培养物保藏中心选取九株 L. monocytogenes，商业冷熏三文鱼购自爱尔兰 Cork 当地商店，盐含量 2.9%，pH 6.1。挑战试验按 EURL-Lm 技术指导文件，将九株菌单独接种，于 4°C、10°C、20°C 储存，实际记录平均为 4.1°C、9.6°C、19.8°C，分别储存 36 d、12 d、6 d，并用 Oxford Listeria agar 计数。生长曲线用 Baranyi 和 Roberts、Buchanan、Gompertz 模型及 DMFit 拟合；与 ComBase、PMP、FSSP 和 Cornu et al. 的烟熏三文鱼二级模型比较；用线性混合效应模型和组内相关系数（ICC）分析菌株变异，并以 Welch t 检验等比较菌株特征分组差异。

研究结果：结果部分小标题为“L. monocytogenes 菌株与产品特征”“L. monocytogenes 菌株在 4.1°C、9.6°C 和 19.8°C 烟熏三文鱼上的生长速率变异性”“菌株特征对生长速率的影响”。在“L. monocytogenes 菌株与产品特征”中，EURL-Lm 指南要求挑战试验菌株应在低温 8°C、pH 5、低 a_w 0.95 下具有定义的最大生长速率；研究人员还依据先前盐和冷耐受实验、EURL-Lm 指南指定菌株、海产与非海产来源、谱系 I 和 II、多个克隆复合体进行选择。实际储存温度平均为 4.1°C、9.6°C、19.8°C。未接种样品背景菌群在 4.1°C 下 200 h 从低于检测限增至 3 log₁₀ CFU/g，在 9.6°C 下 50 h 增至 3 log₁₀ CFU/g；对照样品在 Oxford Listeria agar 上于 4.1°C 和 9.6°C 所有时间点均清晰，但 19.8°C 第 5 天出现无典型李斯特菌形态的菌落。在“生长速率变异性”中，4.1°C 下 Gompertz 和 Baranyi 和 Roberts 模型给出的 μ_max 范围为 0.0195–0.0355 h^?1，CC121 菌株最高；DMFit 和 Buchanan 模型估计较慢；Baranyi 和 Roberts 模型拟合最佳，平均 R² 为 0.9852，标准回归误差（SER）为 0.2351。与三级模型比较，4.1°C 下若干菌株生长速率超过 ComBase、PMP 和 FSSP 预测，多数高于 PMP；DMFit 估计较慢且与 PMP 一致，低于 ComBase 和 FSSP。9.6°C 和 19.8°C 下实验生长速率一般低于 ComBase、PMP 和 FSSP 预测，PMP 最一致。4.1°C 和 9.6°C 下多数菌株高于 Cornu et al. 二级模型预测，19.8°C 下更接近。Cornu et al. 模型总体最接近实验 μ_max（偏差因子 Bf 0.841，准确因子 Af 1.297），PMP 偏差最大（Bf 0.532，Af 1.910）。方差分解显示 ICC 在 4.1°C 为 79.9%，19.8°C 为 82.8%，9.6°C 为 48.9%；菌株偏差方向在各温度下保持一致。在“菌株特征对生长速率的影响”中，聚类分析表明生长速率不因菌株来源、盐耐受或冷耐受显著不同，而谱系与 4.1°C 和 19.8°C 下较高生长速率相关。

讨论与结论翻译：讨论部分指出，冷熏三文鱼尽管有盐、烟熏和冷链多重障碍，仍易发生 L. monocytogenes 生长；以往多菌株生长速率数据有限。本研究首次详细定量比较大量遗传多样、单独测试的 L. monocytogenes 菌株在烟熏三文鱼上的生长速率变异性，并评估 PM 工具与这种变异性的关系。Kang et al. 曾在 7°C 下研究四株遗传不同菌株，μ_max 为 0.022–0.027 h^?1，但主要关注腌制和冻融影响；Bolívar et al. 在烟熏三文鱼 paté 中研究六株菌，报告不同温度下 μ_max 范围及 20°C 更明显变异，但基质为 paté 而非商业切片；Kang et al. 还报道九株混合物在 4°C、10°C、20°C 的生长速率，但混合物不能确定菌株特异变异性。本研究中，4.1°C 和 19.8°C 的 ICC 点估计较高，表明菌株身份是 μ_max 变异的主要来源；9.6°C 的 ICC 较低，提示中间温度下可能存在更异质的生理反应。与 Aryani et al. 报道相似。与 PM 比较时，4.1°C 下部分菌株，尤其 CC121，超过 Baranyi 和 Gompertz 模型预测；Cornu et al. 的单株研究也曾在某些条件下高于某些二级模型预测。Cornu et al. 模型因基于冷熏三文鱼基质特异数据，包括盐、酚类化合物和 a_w 等产品内在特征，与实验值最接近。Dalgaard and J?rgensen 和 Giménez & Dalgaard 曾报告自然污染或混合物接种的冷熏三文鱼中 L. monocytogenes 生长慢于 ComBase 预测，与本研究中温和滥用和室温下实验速率慢于常用 PM 工具预测一致。谱系而非来源、盐耐受或冷耐受与 4.1°C 和 19.8°C 生长差异相关，提示谱系可能比当前 EURL-Lm 表型选择更贴近生长行为，但因菌株和谱系数量有限需谨慎。T_2log 估计显示，排除滞后期时，达到 2-log CFU/g 增长的时间约为 4.1°C 下 2–4 d、9.6°C 下 1–2 d、19.8°C 下 0.4–0.7 d；包括滞后期时约为 17–27 d、4–7 d 和 1–3 d。DMFit 与 R 因参数化不同可收敛至不同点，95% 置信区间覆盖 81.5% 的 μ_max 和 77.8% 的 λ 比较，差异集中在 4°C。背景菌群在滥用温度可达 9 log₁₀ CFU/g，可能通过竞争影响 L. monocytogenes；烟熏酚类也影响生长，产品报告酚浓度为 10 ppm；4°C 下较长滞后期 340–560 h 可能由低温、烟熏酚类和背景菌群共同造成。局限包括挑战试验设计、接种样品不能完全代表自然污染产品、菌株数量有限及单一商业产品/批次。结论翻译：在挑战试验条件下，烟熏三文鱼上 L. monocytogenes 在冷藏和室温的生长受多重障碍相互作用塑造，并造成生长速率菌株变异。本研究在相同挑战试验条件下为九株遗传和表型多样菌株生成详细菌株特异性生长数据。在 4.1°C 下，若干菌株超过 ComBase、PMP 和 FSSP 预测，而在滥用和室温条件下实验确定生长速率显著慢于模型预测。此外，在该数据集中未检测到菌株来源或实验室培养基中冷、盐耐受特征与挑战试验中菌株表现之间的明确关联。总体，这些发现强调在解释预测微生物学输出和设计挑战试验研究时考虑菌株变异和食品基质效应的重要性。