《Journal of Hazardous Materials Advances》：Toxicological impact of chronic inhalation exposure to propylene glycol aerosols generated by E-cigarettes: induction of alveolar destruction in mice
编辑推荐：
• 电子烟气溶胶由用作食品添加剂的 propylene glycol（PG，丙二醇）产生。
• 小鼠吸入 PG 可诱导肺部炎症、氧化应激和凋亡。
• 模拟人类使用的慢性 PG 暴露导致肺气肿样改变。
• 首次证据表明，仅吸入 PG 的气溶胶可能有害，需要严格谨
• 电子烟气溶胶由用作食品添加剂的 propylene glycol（PG，丙二醇）产生。
• 小鼠吸入 PG 可诱导肺部炎症、氧化应激和凋亡。
• 模拟人类使用的慢性 PG 暴露导致肺气肿样改变。
• 首次证据表明，仅吸入 PG 的气溶胶可能有害，需要严格谨慎。
• 这些发现引发对含 PG 电子烟产品的公共卫生关切。
研究背景与问题：传统可燃卷烟烟雾含超过5,000种化合物，包括尼古丁、乙醛、甲醛、多环芳烃、亚硝胺及氰化氢等刺激物，暴露可导致慢性支气管炎和肺泡破坏，进而引起慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD），后者为全球第四位死因。世界卫生组织通过《烟草控制框架公约》减少烟草供需。近年来，电子烟（E-cigarettes）和加热烟草产品（heated tobacco products）等新型烟草产品全球流行，因被宣传较可燃卷烟危害更低。电子烟通过线圈加热含尼古丁、propylene glycol（PG，丙二醇）、glycerol（Gly，甘油）和香料的溶液，加热烟草产品加热含 PG 和 Gly 的烟叶。两者在200–350°C产生气溶胶，低于可燃卷烟，减少有害燃烧产物。但化学分析显示，尽管焦油降低，加热烟草产品 PG 排放量较可燃卷烟高10–20倍，电子烟中 PG 是主要气溶胶成分，浓度高数个数量级；已有报告显示可燃卷烟 PG 约11 μg/支，加热烟草产品270–19,000 μg/支，电子烟230,000–310,000 μg/15口，Gly 相应为59 μg/支、4,000–6,900 μg/支、98,000–130,000 μg/15口。新型烟草产品毒理风险证据增加。多数研究聚焦尼古丁相关毒性，电子烟成分高度可变且易修改，混合溶液研究居多，单一组分生物效应研究有限。可燃卷烟因导致进行性肺泡破坏和肺气肿而公认有害，但新型烟草产品是否造成类似组织损伤尚不明确。PG 具有润湿、保湿、防腐和乳化特性，美国食品药品管理局认为经口摄入低毒，广泛用于食品、化妆品和药品；PG 可溶解稳定尼古丁，加热产生小于1 μm颗粒，因此作为大多数新型烟草产品的溶剂和尼古丁载体，并提供吸入喉部刺激感。既往研究显示，小鼠吸入 IQOS 可致肺气肿，微阵列分析显示肺内凋亡相关通路上调；体外研究显示，人小气道上皮细胞（human small airway epithelial cells, SAECs）暴露 PG 和 Gly 时，PG 细胞毒性更强，包括抑制增殖和降低细胞活力。但吸入 PG 安全性未知，其毒理特征可能因暴露途径不同而异。电子烟在室内和车辆等封闭环境使用增加，因低气味和无可见烟雾，PG 气溶胶可能使旁观者无意识暴露，已有暴露者尿可替宁升高报告。因此，吸入 PG 的肺靶器官毒性受到风险评估关注，需要全面危害评价。该研究旨在用模拟人类使用条件的实验模型，检查 PG 经呼吸道吸入暴露后的肺毒性，并评估其在这些产品中使用相关的潜在风险。
研究人员开展研究：研究人员使用12周龄雄性 C57BL/6J 小鼠，采用商业电子烟设备，填充100% PG，通过小动物烟雾暴露装置模拟人使用，进行4周经鼻口吸入暴露；设置50 W（0.2 Ω）和15 W（1.2 Ω）两组及对照 Air 组。研究得出，慢性 PG 吸入诱导肺炎症、氧化应激、DNA 损伤和凋亡，并导致显著肺气肿样改变，即使仅吸入 PG 且较低功率也观察到风险。该研究首次提供吸入 PG 单独暴露可致体内肺泡破坏的证据，提示含 PG 新型烟草产品可能导致肺损伤，具有公共卫生和监管意义。
关键技术方法：研究人员使用12周龄雄性 C57BL/6J 小鼠（购自 Oriental Yeast，日本），以商业电子烟设备 DRAG X PRO（Voopoo，中国）配合0.2 Ω和1.2 Ω线圈，填充100% PG，经小动物烟雾暴露装置（Model SIS-CS，Shibata Scientific Technology，日本）暴露4周，设置30 min/day、6 puffs/min、35 mL/puff、3.5%稀释，分为 PG50W、PG15W 和 Air 组。关键技术包括 flexiVent 肺功能检测、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）细胞与细胞因子分析、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色及平均线性截距（mean linear intercept, MLI）/破坏指数（destruction index, DI）形态计量、免疫组织化学（immunohistochemical, IHC）、Western blot、逆转录实时定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）及气相色谱-质谱联用（gas chromatography–mass spectrometry, GC-MS）/高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）气溶胶成分分析。
研究结果：
3.1 组织学变化与肺功能改变。通过 HE 染色、MLI 和 DI 形态计量，研究人员发现 PG 两组肺泡结构破坏较 Air 组更明显；MLI 显著增加，DI 显著升高，PG50W 肺气肿样改变最明显，PG15W 也有显著但较轻改变。通过 flexiVent 肺功能检测，PG50W 组吸气容量（inspiratory capacity, IC）和呼吸系统动态顺应性（dynamic compliance of the respiratory system, Crs）显著增加，呼吸系统动态弹性（dynamic elastance of the respiratory system, Ers）显著降低，气道阻力（lung airway resistance, Rn）无变化，符合肺气肿改变；PG15W 呈类似趋势，但 Ers 和 Crs 未达统计学显著。结论：PG 吸入导致肺泡扩大和肺泡壁破坏及肺功能异常。
3.2 肺部炎症反应。通过 BALF 细胞计数，PG50W 组总细胞数、中性粒细胞和淋巴细胞显著高于 Air 组，PG15W 呈类似趋势。RT-qPCR 显示 PG50W 组 Nfkb1、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）mRNA 表达增加，PG15W 组 Nfkbia 表达增加。Western blot 显示 PG50W 和 PG15W 组白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和磷酸化 NF-κB p65（p-p65）显著增加，PG15W 组 p-p65/p65 比值显著升高，PG50W 组胞质 NF-κB p65 和胞质 IκBα（inhibitor of NF-κB alpha，NF-κB 抑制蛋白 α）降低。BALF 多重细胞因子分析显示 PG50W 组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte–macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）和 IL-12 p70 增加，PG15W 组肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）增加。结论：PG 暴露引起肺部炎症和 NF-κB 通路激活，轻度暴露早期 TNF-α 相关反应，较强暴露 IL-1β 和 COX-2 上调。
3.3 肺部氧化应激反应。IHC 显示 PG50W 组 8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine, 8-OHdG）/苏木精和4-羟基-2-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal, 4-HNE）/苏木精面积比高于 Air 组，PG15W 类似。RT-qPCR 显示 PG50W 组核因子 E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2–related factor 2, Nrf2）mRNA 增加，两组 NAD(P)H 醌脱氢酶1（NAD(P)H quinone dehydrogenase 1, Nqo1）表达降低。Western blot 显示 PG15W 组核 Nrf2、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）和4-HNE 显著增加，PG50W 组几乎无变化。结论：PG 暴露引起氧化性 DNA 损伤和脂质过氧化；轻度暴露激活 Nrf2 早期适应性应激反应，高暴露时 Nrf2 通路功能性激活可能减弱，抗氧化适应受损。
3.4 肺部 DNA 损伤、细胞周期改变与凋亡。IHC 显示两组单链 DNA（single-stranded DNA, ssDNA）/苏木精面积比显著高于 Air 组。Western blot 显示 PG50W 和 PG15W 组 p53、p21、p16 表达增加，两组基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）增加。TdT 介导 dUTP 缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL）染色显示两组 TUNEL 阳性/苏木精面积比高于 Air 组。Western blot 显示 PG50W 组 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2-associated X protein, Bax）/Bcl-2 比值、Bcl-2 同源拮抗/杀伤因子（Bcl-2 homologous antagonist/killer, Bak）和剪切型 caspase-9（cleaved caspase-9）增加。结论：PG 暴露导致 DNA 损伤、细胞周期改变/衰老标志和凋亡，线粒体凋亡通路激活。
3.5 各气溶胶成分浓度。通过气溶胶成分分析，PG、乙醛、甲醛和丙烯醛量在 PG15W 组均低于 PG50W 组。结论：较低功率下 PG 热分解产物生成较少。
讨论部分总结：讨论指出，电子烟和加热烟草产品基础研究中，多数报告无不良事件或较可燃卷烟低毒性的研究由烟草相关公司资助；报告有害效应的研究常归因于尼古丁；专门评估溶剂风险的研究有限。既往两项仅 PG 动物研究分别显示，小鼠直接气管内注射 PG 后 BALF 细胞数和 IL-1β、IL-6 等炎症细胞因子增加，绵羊吸入 PG 后痰 MMP-9 增加；本研究据研究人员所知首次提示 PG 暴露后肺泡破坏可能。研究人员认为 PG 诱导反应机制尚不清楚，可能涉及多个 COPD 样应激通路，因此采用多层面评价。IHC 中 8-OHdG 和 4-HNE 升高提示氧化应激、氧化性 DNA 损伤和脂质过氧化；PG15W 轻度暴露时核 Nrf2 和 HO-1 增加提示早期适应性应激反应，而 PG50W 高暴露时尽管 Nrf2 mRNA 增加，核 Nrf2 和 HO-1 无显著增加，提示严重氧化应激下 Nrf2 通路功能激活减弱；PG50W 中 Western blot 4-HNE 未增加可能因高氧化环境二次变性或分解；Nqo1 在两组降低，提示抗氧化适应受损。BALF 中中性粒细胞和淋巴细胞升高及肺组织 IL-6 增加提示炎症；TNF-α 在 PG15W 升高提示早期炎症反应，PG50W 中 IL-1β 和 COX-2 显著增加；p-p65 两组增加，PG15W p-p65/p65 比值升高，PG50W 胞质 p65 和 IκBα 降低，提示 NF-κB 核转位和 IκBα 降解增强，Nfkbia 在 PG15W 增加提示反馈调节。总体提示炎症进展：轻度暴露 NF-κB 激活先诱导 TNF-α，较强暴露驱动 IL-1β 和 COX-2 等下游介质。IHC 显示两组 ssDNA 增加，提示明显 DNA 损伤；PG15W 略高于 PG50W，可能反映 PG50W 损伤过度。Western blot 显示 p53、p21、p16 及 MMP-2 增加；p53 可能协调基因组稳定、细胞周期停滞和凋亡；炎症激活和 MMP 增加可能反映衰老相关分泌表型，提示细胞衰老参与肺病理过程。Bax/Bcl-2、Bak 和 cleaved caspase-9 增加提示 Bcl-2 家族蛋白平衡改变，线粒体膜不稳定，激活内源性凋亡通路；TUNEL 进一步证实 DNA 片段化。讨论中提出，尽管需验证其他通路和时间效应，PG 吸入诱导功率依赖性肺氧化应激，PG50W 维持更强 NF-κB 介导炎症和 DNA 损伤，随后触发细胞周期停滞、衰老和凋亡，这些相互关联的病理过程可能形成恶性循环，最终导致肺泡破坏。既往体外研究显示，高吸湿性 PG 通过脱水气道表面和经水通道蛋白3（aquaporin 3, AQP3）降低膜流动性损害黏液纤毛清除，清除障碍结合高渗应激诱导炎症细胞因子；高 PG 暴露增加活性氧（reactive oxygen species, ROS）。这些机制可能促成气道功能障碍。既往 IQOS 暴露小鼠微阵列和 PG 暴露 SAECs Western blot 也显示凋亡相关通路激活，支持肺泡破坏机制。COPD 发病机制研究表明可燃卷烟所致肺泡破坏涉及炎症、氧化应激、DNA 损伤、细胞衰老、凋亡和蛋白酶/抗蛋白酶失衡等多条交织通路，但精确相互作用仍不清楚。新型烟草产品有害效应逐渐显现，但许多病理生理方面未知；本研究显示单一组分 PG 即可诱导多重生物应激和肺泡破坏。小鼠模型初始实验50 W在电子烟常用范围（5–200 W，0.1–2.0 Ω），高功率常使用低于1 Ω线圈，即“cloud-chasing” vaping；高功率增加气溶胶生成。为更真实反映人使用，研究人员采用常用设备；气溶胶暴露和稀释浓度与既往可燃卷烟和 IQOS 小鼠暴露研究一致。人类分钟通气量约6 L/min，典型抽吸量约50 mL，假设每分钟4口，吸入烟雾约200 mL/min，对应总通气量3.3%；小鼠分钟通气量约40 mL/min，应用3.5%稀释模拟“正常呼吸伴间歇抽吸”。30 min/day 可燃卷烟烟雾暴露相当于每天9支卷烟，与人类轻度吸烟水平相当。考虑到高功率电子烟可能增加气溶胶生成但用户可能延长抽吸间隔、总抽吸口数减少，而本实验抽吸口数固定，因此额外进行15 W低功率实验；PG15W 也观察到肺气肿，提示即使较少 PG 气溶胶也可能有风险。PG 气溶胶量15 W低于50 W，每日液体消耗15 W为3 mL，50 W为10 mL；电子烟用户典型每日消耗约3 mL至超过10 mL（cloud-chasing），提示本研究暴露水平大致适当。高功率还关注加热副产物；PG 热分解可产生乙醛、甲醛、丙烯醛和 ROS，温度越高生成率越高。即使在低功率、这些化合物形成极少条件下，仍观察到肺 DNA 损伤、细胞周期停滞和肺泡破坏。本研究中各气溶胶成分浓度与既往电子烟报道相当，乙醛水平约为可燃卷烟报道的1/20。Uchiyama 等报告卷烟烟雾含乙醛1200 μg/支、甲醛42 μg/支、丙烯醛100 μg/支；本研究中 PG50W 条件（3.5%稀释）直接测量未调整舱内浓度为乙醛3.3 mg/m3、丙烯醛0.031 mg/m3、甲醛1.35 mg/m3，远低于主流卷烟烟雾（例如甲醛60–130 mg/m3），可能与车辆内部等封闭环境吸烟时水平相当，提示暴露水平在现实微环境可能遇到范围内。PG15W 组甲醛和丙烯醛低于 PG50W 组一半，提示低功率下 PG 热分解产物贡献较小。这些结果提示，电子烟设备产生的仅 PG 气溶胶即使在较低功率也可诱导肺泡破坏，尽管不能完全排除少量热分解产物贡献；在最佳暴露范围内，PG 毒性效应可能随功率和体积放大。研究限制包括：每组6只、总 n=18 同时分析，样本量较小可能因统计效力有限而遗漏某些效应；暴露模型限制，每只动物进行多项操作，部分 RT-qPCR 分析因技术限制样本量减少，但通过独立两组比较实验确认可重复性；Western blot 和 RT-qPCR 使用全肺匀浆，提供群体水平数据，可能低估特定细胞类型变化；基于既往研究仅使用雄性小鼠以避免女性性激素混杂；本研究仅关注 PG，仅使用一种电子烟设备，因与内部小动物吸入暴露系统兼容；因此无法评估性别差异、单独 Gly 效应、与 Gly 等其他成分相互作用及设备差异。但在所检测因素中观察到显著差异，证明 PG 对肺的明确效应。基于 SAECs 体外研究，这些体内发现通过多层面方法证明气道吸入 PG 的有害效应；首次显示在生理相关暴露条件下单独吸入 PG 可在体内诱导肺气肿样病理改变。鉴于电子烟和加热烟草产品近期才广泛采用，其长期安全性，包括未来 COPD 和其他慢性肺病风险，仍在很大程度上未知。本研究中功率依赖性肺气肿改变提示，PG 吸入可能根据使用模式导致人肺泡损伤。因此，本研究对所有含 PG 新型烟草产品提出重要警告，PG 在空气传播排放背景下可能被视为危险物质，并可能为未来监管考虑提供科学基础。这些结果提示当前安全指南可能低估 PG 气溶胶潜在生物效应，需要进一步评估消费者产品监管，尤其在年轻人群吸入风险评估背景下。
研究结论部分翻译：PG 是电子烟和加热烟草产品的主要成分。旨在模拟人类吸烟暴露的 PG 吸入暴露诱导严重氧化应激并激活 NF-κB 介导的炎症，导致 DNA 损伤、凋亡，并以功率依赖方式引起显著肺气肿样改变。这些发现表明，吸入含 PG 的新型烟草产品可能导致肺损伤，从而引发重要公共卫生关切。
