《Journal of Infection》：Clinical Accuracy and Operational Evaluation of a Novel Nanopore Based 16S Diagnostic Pathogen Detection Workflow
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基于培养的方法仍是常规诊断实验室中致病菌检测的标准实践，但在低细菌载量或抗生素暴露样本中常无法识别病原体。虽然全长16S rRNA测序提高了检测能力和分类分辨率，但其应用受到生物信息学复杂性和操作可行性的限制。研究人员开发了一种基于牛津纳米孔技术（ONT）的内
基于培养的方法仍是常规诊断实验室中致病菌检测的标准实践，但在低细菌载量或抗生素暴露样本中常无法识别病原体。虽然全长16S rRNA测序提高了检测能力和分类分辨率，但其应用受到生物信息学复杂性和操作可行性的限制。研究人员开发了一种基于牛津纳米孔技术（ONT）的内部全长16S检测方法，并配套设计了一个面向非专业人员的开源自动化分析流程。在这项初步研究中，对116份培养阴性临床样本进行了测序，其中86份与外包的标准16S或物种特异性PCR进行了平行比较。医学微生物学家在不知晓比较结果的情况下独立评估了临床相关性。同时评估了周转时间、工作流程整合及成本需求。与外包16S检测相比，内部工作流程显示出100%的阳性一致性百分比（12/12；95%置信区间：75.7%–100.0%）。该方法将临床诊断检出率从14.0%（12/86）显著提升至37.2%（32/86）（p<0.0001），在外包检测报告为阴性的额外20份样本中鉴定出了临床相关微生物。它提高了物种水平的分辨率，并识别出了多微生物感染（n=8）。NanoPATH流程通过单命令工作流生成临床可解读的输出，实施模型表明每周运行两次即可达到与外包检测相当的周转时间，且每次运行9份样本时可实现成本中性。一种开源、基于ONT的16S工作流程适用于常规诊断实验室，无需专业生物信息学人员即可操作，显著改善了临床样本中的病原体检测。通过克服分析和操作障碍，该方法为将测序诊断整合到标准临床工作流程并改善患者护理提供了实用框架。
研究背景与问题
在常规临床诊断实验室中，基于培养的方法仍是致病菌检测的标准手段，但在处理低细菌载量样本或曾接受抗生素治疗的患者样本时，常常无法确定感染的病原学病因。分子方法如靶向定量聚合酶链反应（qPCR）虽提高了敏感性，但本质上局限于预先设定的目标微生物。相比之下，基于测序的方法提供了一种不依赖预设病原体的策略，能够提高培养阴性样本的诊断检出率。16S核糖体RNA（rRNA）基因全长约1500 bp，包含九个高变区（V1-V9），其间穿插保守序列，使得通用PCR扩增和物种水平的区分成为可能。传统的短读长测序针对孤立区域如V3-V4，而长读长测序则捕获全长16S基因，提供更高的分类分辨率和物种水平鉴定能力。
尽管具备这些优势，16S检测在常规诊断实验室中的应用仍然有限。它通常被外包给专业服务商，导致成本高昂、周期延长以及与临床工作流程的整合度降低。本地化实施的一个关键障碍是对专业生物信息学人才的依赖，以处理和解读测序数据。此外，很少有研究探讨如何从后勤和财务角度将这些检测方法实际运作并整合到常规诊断实验室中。
为了应对这些障碍，研究人员开发了一套基于牛津纳米孔技术（ONT）的内部全长16S rRNA测序工作流程，并配套设计了自动化分析流程NanoPATH，该流程无需专业生物信息学知识即可执行。本研究评估了其相对于当前外包标准诊疗方案的诊断性能，并在常规临床诊断实验室环境中评估了其操作整合性、周转时间（TAT）和成本效益。
关键技术方法
研究人员使用了ONT平台进行全长16S rRNA基因测序，并自主开发了名为NanoPATH的分析流程。该流程基于NanoCLUST改编，核心分析框架包括UMAP降维、HDBSCAN聚类、Canu纠错和共有序列抛光。NanoPATH的关键改进包括自动质量控制、初级读段分类以及多分类器读段分配，具体阶段为：质量控制和预过滤（移除短于1400 bp的读段，可选Kraken2步骤去除非16S读段）、初级分类（使用Kraken2对NCBI 16S RefSeq数据库进行分类）、降采样与聚类（每个样本降采样至50000条读段，转换为5-mer频率图谱后聚类）、共有序列生成（通过fastANI选择代表性读段作为草稿参考，经minimap2比对、Racon校正和Medaka抛光生成高精度共有序列）、以及多分类器分类学分配（并行使用Kraken2、seqmatch和BLAST进行最终鉴定）。样本来源于Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust的连续培养阴性无菌部位残留样本，共116份，收集于2023年3月6日至9月19日期间。
研究结果
检测验证：在制造商推荐条件（10 ng输入，25个PCR循环）和低输入条件（1 ng输入，35个PCR循环）下均获得了相似结果，能检测到Zymo标准品中丰度最高的3种细菌，但遗漏了相对丰度低于0.0089%的微生物。系列稀释实验显示，检测下限取决于总输入量和目标相对丰度。对于复杂微生物环境中的低丰度目标，当总输入量为0.001 ng、目标相对丰度为0.89%（8.9 fg）时仍可实现稳健检测。当目标相对丰度降至0.089%或物种特异性输入低于0.89 fg时，检测变得不稳定甚至失败。
临床样本验证：在86份平行检测的样本中，内部方法在76/86份样本中检测到了16S基因并鉴定了微生物，而外包实验室仅为13/86份。经过临床审查后，内部工作流程在32/86份（37.2%）样本中鉴定出了临床相关微生物，而外包实验室为12/86份（14.0%），代表临床诊断检出率显著提升了2.7倍，绝对增加23.3%。内部检测与外包检测的阳性一致率为100%（12/12），检测到了外包实验室识别的所有临床相关病原体。内部方法还识别出了8例临床相关的多微生物感染，而外包实验室在其中3例中只检测到单一微生物，其余5例未检测到任何微生物。
检测实施评估：根据研究时间戳，从样本采集到提出16S检测请求的中位前分析时间为63.2小时。外包16S检测路径从中位周转时间（TAT）为78.4小时，阳性样本则升至121.7小时。建模显示，若采用每周两次的运行计划，内部工作流程的预计总中位TAT为91.5小时，虽整体略长，但阳性样本的报告速度更快。成本分析显示，由于测序的高固定成本和每增加一份样本仅6.88英镑的低增量成本，每份样本的成本随多重检测通量的增加而非线性下降。当每次运行9份样本时（69.72英镑/样本），内部工作流程的成本效益即与外包检测（69.96英镑/样本）持平。当扩展至最大试剂盒容量21份样本时，成本进一步降至33.87英镑/样本。
讨论与结论
研究表明，全长16S测序工作流程可以在常规诊断实验室中既具备分析有效性又具备实际可操作性。虽然测序诊断在某些方面优于培养法，但受限于生物信息学专业知识和缺乏操作验证。通过结合可由非专业人员执行的自动化分析流程和经过临床验证的ONT检测方法，本研究解决了这两大障碍。内部工作流程将诊断检出率提升了2.7倍，提高了物种水平分辨率，并解决了传统方法常遗漏的多微生物感染问题。虽然宽泛的宏基因组测序提供完全无偏倚的方法，但其高成本和计算需求限制了在成本敏感环境中的应用。全长16S测序则在诊断广度、成本和操作简便性之间取得了务实的平衡。研究局限性包括背景DNA污染的可能性以及单中心设计。操作模型显示，每周两次的运行计划可提供临床可操作的时限，且在每次运行9份样本时即可实现成本优势。结论部分指出：基于ONT的全长16S测序工作流程可以成功转化为常规诊断实践。通过成功克服分析和操作障碍，该研究将改进的病原体检测与易于操作的NanoPATH分析流程相结合。由此产生的可行实施模型为将测序诊断整合到标准临床工作流程并改善患者护理提供了实用途径。
