中国第三代头孢菌素耐药脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的PBP2七位点突变、基因组特征与跨区域传播

《Journal of Infection》：The emergence and spread of third-generation cephalosporin-resistant Neisseria Meningitidis in China

　　

脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）是侵袭性脑膜炎球菌病（invasive meningococcal disease, IMD）的病原体。尽管第三代头孢菌素（third-generation cephalosporins）仍为推荐的经验性治疗，但全球报道的耐药分离株日益增多。本研究旨在阐明脑膜炎奈瑟菌第三代头孢菌素耐药的遗传与进化机制。研究人员进行了全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）和表型抗生素敏感性试验，并全面表征了耐药株的潜在耐药决定因素、基因组特征及进化轨迹。鉴定出7个可能与耐药相关的PBP2（penicillin-binding protein 2, PBP2）突变位点，包括A311V、R468K、E469K、D/N472E、L/P480A、T483S和G545S。基因组分析显示，携带这7个潜在耐药决定突变位点的菌株在过去二十年内出现，并呈增加趋势。这些菌株大多数分离自中国北方地区。优势突变株主要属于主要流行菌株，如cc4821、cc23、B血清群和Y血清群。系统发育分析揭示存在跨区域传播现象。鉴定出3种潜在跨区域传播的第三代头孢菌素耐药菌株类型，即cc4821-ST-8920-NEIS1753_3923-penA795、ST-14760-NEIS1753_3652-penA1357和cc23-ST-18108-NEIS1753_5058-penA1258。本研究系统分析了第三代头孢菌素耐药脑膜炎奈瑟菌株的表型和遗传特征。这不仅加深了对耐药机制的理解，也为临床快速检测、实验室监测以及跨区域传播风险的预防与控制提供了科学依据和实践指导。

作者Hairui Wang、Li Xu等开展的论文围绕中国第三代头孢菌素耐药脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的出现与传播。脑膜炎奈瑟菌是侵袭性脑膜炎球菌病（invasive meningococcal disease, IMD）的病原体，人类是其唯一自然宿主，健康人群鼻咽携带率约10%。尽管已有疫苗和抗生素，IMD因进展快、后遗症重仍威胁全球。奈瑟菌属中，致病种如脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌，共生种如N. cinerea、N. mucosa等通常最小抑菌浓度较高，并可构成耐药基因储库，耐药决定簇多从口咽共生种获得。与淋病奈瑟菌不同，脑膜炎奈瑟菌耐药发展相对缓慢，但青霉素、磺胺和氟喹诺酮耐药株增加。第三代头孢菌素是首选治疗，耐药水平仍低，但全球已报道头孢菌素耐药或不敏感分离株。penA基因编码的青霉素结合蛋白2（penicillin-binding protein 2, PBP2）突变是青霉素和头孢菌素敏感性下降或耐药的主要机制，可降低PBP2与头孢菌素结合亲和力；mosaic penA等位可通过DNA转化和重组产生，尤其来自口咽共生奈瑟菌。因此，研究人员基于中国耐药分离株，分析耐药机制、鉴定潜在PBP2突变位点，并系统描述耐药表型、产生机制、溯源和遗传特征，为未来防控提供病原学基础。

关键技术方法方面，研究人员采用基于来源、地理分布和分离时间的分层随机抽样，对中国实验室和China PIN（Chinese Pathogen Identification Net）收集的脑膜炎奈瑟菌代表株进行头孢噻肟（cefotaxime, CTX）和头孢曲松（ceftriaxone, CRO）梯度条扩散法（E-test）药敏试验并测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）；开展Illumina和PacBio全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）；从NCBI、PubMLST、China PIN及本实验室共收集49958个基因组，进行多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）/克隆群（clonal complex, CC）、penA和NEIS1753等位、血清群骨架、CARD耐药基因预测；以核心单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）和核心基因组多位点序列分型（core genome multilocus sequence typing, cgMLST）构建系统发育树。

在“头孢菌素耐药及相关突变”方面，通过对20株第三代头孢耐药株和20株敏感对照株的药敏及Spearman相关分析，研究人员发现仅PBP2突变与CTX和CRO耐药表型强相关。多序列比对鉴定出7个PBP2突变位点：A311V、R468K、E469K、D/N472E、L/P480A、T483S和G545S，这些位点在耐药株中完全相关。突变株MIC均高于0.12 μg ml^?1，范围为0.125 μg ml^?1至1.5 μg ml^?1，且CTX的MIC一般高于CRO。

在“流行病学与遗传特征分析”方面，从49958个基因组中鉴定出124株同时携带上述7个突变位点，占0.25%；其中28株来自患者，84株来自无症状携带者，12株来源不明。所有124株均分离自中国，来自17个省市区，主要分布于华北和西北，青海、河北、上海、河南、山东、四川、新疆、山西占90.32%。菌株2013年首次在河北分离，后逐年增加，2017、2021和2024年出现峰值，近6年占73.39%。主要ST为18108、5798、7962和8920；主要CC为cc4821和cc23，分别占42.74%和13.71%。血清群骨架以B和Y为主，分别占66.94%和19.35%。penA等位分型显示59种NEIS1753变异和30种penA变异，主要NEIS1753_5058、3923、5643、5666及penA795、penA964、penA1258、penA1355。

在“系统发育与比较基因组分析”方面，以2013年最早菌株为根构建核心SNP系统发育树，聚类与ST、CC和NEIS1753等位一致，部分penA等位位于不同分支。共发现3条潜在耐药克隆跨区域传播链：cc4821-ST-8920-NEIS1753_3923-penA795，10株，地理分布最广，覆盖7省，2020年江苏首次，B骨架，后在广东、山东、湖南、河南、内蒙古、福建出现，并在河南发生胶囊转换变为C骨架；ST-14760-NEIS1753_3652-penA1357，2株，2017年河南和北京，均B骨架；cc23-ST-18108-NEIS1753_5058-penA1258，21株，为最大最流行克隆群，均来自河北、天津、山西，2023年河北首次，Y骨架，并持续在天津、河北和山西检出，近4年显著增加。cgMLST分析结果与之一致。

讨论部分指出，当前脑膜炎奈瑟菌对氯霉素、磺胺、环丙沙星和喹诺酮耐药明显增加，但对头孢菌素仍相对敏感。本研究的耐药株未发现耐药相关基因缺失或插入，而与敏感株相比存在PBP2突变。奈瑟菌对第三代头孢菌素耐药与PBP2改变有关，penA等位广泛用于分析耐药表型。A311V在淋病奈瑟菌中可导致扩展谱头孢菌素高水平耐药；本研究中R468K、E469K、D/N472E、L/P480A首次被发现与耐药相关，A311V、T483S和G545S首次进行统计相关分析。在淋病奈瑟菌中，这些突变可通过改变β₃-β₄ loop构象降低结合亲和力，从而赋予β-内酰胺和第三代头孢菌素耐药；但七位点与耐药表型的因果关系及各站点单独贡献仍需基因编辑等功能实验验证。124株突变株主要来自中国北方，cc4821和cc23占一半以上，B和Y血清群合计超过85%；所有cc23突变株均为Y骨架，并呈显著时空聚集。由于数据库来源和采样不平衡，可能存在重复株，研究人员以ST、CC、NEIS1753和penA四个特征去重，保留87株后趋势与124株基本一致，但未来仍需持续监测。因PBP2第311位不在penA截短序列内，本研究采用penA全长进行分型；NEIS1753_5058和penA1258株完全相同，是流行耐药突变株。系统发育分析发现部分耐药株已区域传播，传播中同源重组可能导致胶囊转换和血清群改变。总体耐药仍低，但跨区域传播可能导致耐药水平快速上升并增加疾病负担，监测重点应关注三种潜在传播株型，尤其NEIS1753_3923、3652、5058及NEIS1753_5058。

结论翻译：在本研究中，研究人员鉴定出第三代头孢菌素耐药脑膜炎奈瑟菌株以及PBP2上7个可能导致第三代头孢菌素耐药的突变位点。携带这7个潜在耐药决定突变的菌株近二十年内在中国出现，并呈逐年增加趋势。这些突变株类型主要位于主要流行类型，并存在跨区域传播现象。相关突变位点及脑膜炎奈瑟菌对第三代头孢菌素耐药流行病学特征的发现，将有助于及时检测耐药株，并对有效控制耐药株跨区域传播具有重要公共卫生意义。