聚天冬氨酸对草酸钙晶体变形行为的影响

《Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials》：The influence of poly(aspartic acid) on the deformation behavior of calcium oxalate crystals

　　

**摘要**

本研究设计了一种模块化微流控装置，用于在玻璃基底上生长单个的合成草酸钙一水合物晶体，并可在有或无聚电解质的条件下进行。模块化设计允许将玻璃基底及其附着的晶体从装置中取出，从而使单个COM晶体能够通过显微镜进行识别和定位，以便后续表征。对这些COM晶体进行了定性（形态、拉曼光谱）和定量（表面粗糙度和纳米力学性能）测量，以评估修饰剂介导的结晶的影响。我们观察到，随着聚电解质浓度的增加，晶体形态发生了显著变化，但拉曼光谱验证了所有晶体均为一水合物物种。研究发现，在有聚电解质修饰剂存在条件下生长的晶体，其表面粗糙度有所增加，但在本研究所用的各浓度之间无显著差异。虽然纳米力学性能（等效模量和硬度）并未因引入聚电解质修饰剂而受到显著影响，但随着聚合物浓度的增加，"弹跳"事件减少。我们推测，这种行为部分归因于聚电解质修饰剂导致的表面粗糙度增加。此外，聚电解质可能还会改变应力分布或抑制压痕过程中的突然塑性事件。总之，这些结果表明，聚电解质介导的结晶可显著减少COM晶体的"弹跳"事件，从而可能增强其抗位错和抗裂纹扩展的能力。这些结果为有机大分子在草酸钙肾结石粉碎与排出过程中的力学响应作用提供了新的见解。

**引言**

肾结石是一种痛苦且易反复发作的疾病，影响全球约12%的人口。(1), (2) 通常需要进行手术干预，以缓解排便过程中难以忍受的疼痛并防止肾功能丧失。3 肾结石病的患病率在全球范围内持续上升，而目前的治疗策略无法预防复发或解决潜在疾病的进展。(4), (5) 肾结石形成的机制尚未完全了解，因此目前尚无根治性疗法或预防性药物存在。

大约70%的人类肾结石主要由草酸钙一水合物组成。(6), (7), (8), (9) COM，又称一水合草酸钙，以单斜结构结晶，通常呈六角片状，是最热力学稳定的草酸钙晶相（图1）。(10), (11) 然而，在肾脏中，COM以球粒形式形成，作为与有机基质紧密聚集的聚集体。12 因此，肾结石通常含有少量但持续存在的有机物，主要是蛋白质。(13), (14)

有机物或"晶体生长修饰剂"可能通过调节晶体的成核、生长和聚集来影响结石的发病机制。15 例如，Mallam等人展示了在阴离子聚电解质存在下生长的、类似肾结石形态的COM晶体，该聚电解质模拟了内在无序蛋白质。16 Kulisha等人在骨桥蛋白存在下生长COM晶体时观察到类似的球粒形态，骨桥蛋白是一种阴离子蛋白，通常存在于肾结石基质中。(17), (18) 小有机化合物也会影响COM晶体的形成。亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸等氨基酸可促进COM成核。19 柠檬酸和羟基柠檬酸则通过阻断弯折位点和台阶位点，降低解吸的能量势垒，从而抑制COM结晶。20 总之，许多晶体生长修饰剂可能最终影响结石的发病机制，突显了需要理清它们对COM肾结石形成的各自贡献。

在所有尿路结石中，COM结石在体外碎石手术中最为抗破碎。(12), (21) 这种抗性通常被假设为由多相有机相存在所致的复合增韧机制引起。(21), (22) 然而，支持有机成分在提高断裂韧性或弹性性能方面作用的直接实验证据仍然有限。大多数研究肾结石形成的研究实际上集中在晶体形态、聚集和组成方面，使用成像和光谱技术（包括拉曼光谱、红外光谱和X射线衍射）来研究在蛋白质或模型添加剂（如聚电解质和肽类）存在下COM晶体的变化。(15), (23), (24), (25)

几项研究报告了肾结石的力学性能，包括硬度和弹性模量，采用了维氏压痕、纳米压痕和声学测量等方法。(26), (27), (28) 然而，仅有一项研究表征了来自山核桃壳的分离COM晶体的力学性能。29 不幸的是，这些COM晶体并非球粒状，不能很好地代表人类COM结石。此外，纳入的有机或多相相对这些性能的影响仍很大程度上未被探索。尚无研究系统地将COM晶体的力学行为作为聚合物浓度的函数进行考察。

了解聚合物介导的生长如何改变COM晶体的力学响应，可能为结石形成中的结构-性能关系提供见解。然而，传统的体外结晶平台在烧杯、瓶和烧瓶中通过过饱和人工尿液溶液合成COM晶体，结晶条件各不相同。(17), (30), (31) 这些研究中形成的晶体通常太小（范围为5×5至10×50 μm，宽×长），无法进行力学性能测量，因为即使是纳米压痕也需要大约100×100 μm的面积进行压痕。32 此外，批次系统的生长条件不能准确代表肾脏环境，形成的晶体通常也不类似于生理结石。Mallam等人详细介绍了一种新方法，在硅胶凝胶上生长COM晶体，使其更接近生理结石。16 然而，提取和固定亚厘米级晶体进行力学测试似乎并不简单。

为了模拟肾脏的流动行为，Kulisha等人开发了一种微流控装置，能够实现COM晶体的原位生长。17 借助此平台，COM晶体的生长、分离和纳米压痕测量成为可能。因此，在本研究中，我们采用了类似的微流控装置结晶平台，并对其进行了修改，以便直接在COM晶体上进行纳米压痕和表面性能测量。我们在有或无聚电解质修饰剂的条件下生长晶体，以鉴定有机物是否以及如何改变力学和形态性能。

**部分摘要**

**流动池组装以在有或无聚电解质生长修饰剂存在下成核和生长草酸钙晶体**

流动池装置基于Kulisha等人的设计构建（图2A）。17 该装置由两个入口通道组成，供应含有人工尿液溶液的通道，分别包含1 mM草酸钠或1 mM氯化钙，它们在中央生长通道内汇合，在此处发生草酸钙晶体形成。除了草酸钠或氯化钙外，两种人工尿液溶液还含有150 mM氯化钠和10 mM

**聚合物介导的COM晶体的定性评估**

通过扫描电子显微镜，由聚合物介导的COM晶体外观上存在显著差异变得非常明显。在没有聚阴离子介导剂的情况下，(100)面如预期呈现延长的六边形形状，由精细、尖锐的边缘组成。40 然而，添加聚阴离子后，尖锐的边缘消失，只剩下一般片状形状的残余。总体而言，晶体在所有边缘处均呈圆角，表面粗糙。当聚阴离子从2增加到4时……

**聚天冬氨酸对COM形态的影响**

在有聚阴离子修饰剂存在下，COM晶体的形态类似于生理结石，与其他人通过引入骨桥蛋白所获得的COM球粒相当。(17), (44), (45), (46) Sokol等人展示了球粒状生理COM结石的图像，这些结石据称对冲击波治疗具有更高的抗性，并表现出粘弹性，这表明大分子的影响。12 Aggarwal等人也展示了球粒状……

**结论**

我们报告了首项将合成草酸钙一水合物晶体生长至与纳米压痕兼容的尺寸并对其执行纳米压痕测试的研究。在有聚阴离子修饰剂存在下，晶体形态和表面性能发生了显著变化。在所有聚阴离子修饰剂浓度下，均未观察到纳米力学性能（等效模量和硬度）的统计学显著变化。然而，我们发现聚电解质介导的晶体生长减少了……

**CRediT作者贡献声明**

Matthew Tirrell：撰写——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取。
Jeffrey Wesson：撰写——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，概念化。
Brenna Knight：撰写——审阅与编辑。
Conor Harris：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，可视化，验证，软件，方法论，调查，形式分析，数据管理，概念化。

**利益冲突声明**

? 作者声明，不存在已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本报告中工作的出现。

**致谢**

本研究由美国国立卫生研究院在NIH R01 DK140369资助下提供资金。纳米压痕和原子力显微镜测量在西北大学原子和纳米尺度表征实验中心完成。作者感谢Gajendra Shekhawat为纳米压痕和AFM提供的技术支持。扫描电子显微镜在芝加哥大学地球物理科学系进行，作者感谢Gerard Olack提供的技术支持。

Conor G. Harris | Brenna M. Knight | Jeffrey A. Wesson | Matthew V. Tirrell
芝加哥大学普利兹克分子工程学院，美国伊利诺伊州芝加哥，60637