仿生黏弹性压电水凝胶重构机电微环境以诱导体外成骨相关的细胞反应

《Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials》：Bioinspired viscoelastic-piezoelectric hydrogels reconstruct the mechano-electrical microenvironment to cellular responses associated with osteogenesis in vitro

　　

摘要 天然骨组织具有力学-电学微环境，其特征为基质粘弹性和固有压电性。为再现这些物理特性，本研究以甲基丙烯酸酯明胶（GelMA）作为主要聚合物网络，引入醛基功能化甲基丙烯酰化透明质酸（OHAMA），通过形成可逆席夫碱键赋予粘弹性行为。掺入钛酸钡（BaTiO?，BTO）纳米颗粒，制备出一种超声响应的压电粘弹性水凝胶，命名为PVE-Gel。PVE-Gel保持了适宜的压缩性能，相比GelMA具有更低的溶胀率和更慢的降解速率，并在超声刺激下产生周期性电信号。体外实验表明，超声刺激的PVE-Gel增强了骨髓间充质干细胞（BMSCs）的铺展和迁移，提高了Runt相关转录因子2（RUNX2）和骨钙素（OCN）的表达以及碱性磷酸酶活性，并促进了基质矿化。在巨噬细胞中，超声刺激的PVE-Gel降低了CD86表达并增加了CD206表达，其标志物谱与向修复相关表型的转变一致。这些发现表明，PVE-Gel将基质粘弹性与超声诱导的压电刺激相结合，支持BMSCs的迁移和成骨分化，并在体外改变了巨噬细胞的标志物表达。这些体外发现为在合适的骨缺损模型中进一步评估PVE-Gel的骨修复潜力提供了依据。

引言 由创伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病引起的大面积骨缺损往往超出了骨组织的自身再生能力。这可能导致骨愈合延迟、骨不连以及持续的功能障碍，仍然是骨科和再生医学面临的主要临床挑战[1], [2]。为改善缺损部位的再生潜力，目前的骨修复生物材料通常负载生长因子、生物活性离子、药物、细胞或细胞外囊泡，以支持成骨、血管生成和免疫调节[3], [4], [5], [6]。然而，这些方法主要侧重于补充生物化学信号。在大多数现有策略中，生物材料主要被设计为递送载体，而骨细胞外基质的动态力学和电学特性则较少受到关注[7]。骨并非静态支架，其细胞外基质通过刚度梯度、粘弹性耗散、应力松弛行为和固有压电性传递力学载荷并提供物理信号。这些物理信号影响细胞粘附、迁移、免疫表型和成骨分化[8], [9], [10], [11]。骨缺损不仅破坏了组织结构结构和生物化学信号传导，还破坏了与骨稳态和修复相关的生理力学-电学微环境[12], [13]。应对这一多因素缺陷需要能够重建缺损部位动态力学和电学生物学格局的生物材料设计，同时利用外部施加的机械刺激并将其转导为细胞可检测的信号。

力学微环境是骨髓间充质干细胞（BMSCs）粘附、迁移和成骨分化的重要调节因素[14]。当前基于水凝胶的骨修复策略主要关注弹性模量或刚度，通过增加交联密度或增强组分来近似骨组织的静态力学性能[15], [16], [17]。然而，天然骨细胞外基质是由胶原纤维和矿物相组成的粘弹性复合网络。在持续载荷下，它表现出与时间相关的力学行为，包括应力松弛、蠕变和能量耗散[18], [19]。因此，具有相似初始模量但不同应力松弛速率的基质可以引发显著不同的细胞反应。适当的应力松弛特征允许细胞产生的牵张力对周围基质进行局部重塑。这种重塑可以促进粘附配体聚集、整合素参与和黏着斑成熟，随后促进F-肌动蛋白组装和肌动-肌球蛋白收缩。由此产生的细胞骨架变化将机械信号传递至细胞核，影响YAP/TAZ和RUNX2活性，并激活机械敏感离子通道，从而影响细胞铺展、迁移和成骨基因表达[20], [21], [22], [23]。粘弹性基质还可以耗散瞬态机械能量，减少局部应力集中，并适应持续的细胞介导重塑，为新的骨基质沉积和组织生长创造空间[24], [25]。因此，在保持足够结构稳定性和力传递的同时工程化可调粘弹性和应力松弛，是再现骨力学微环境相关特征并支持成骨反应的重要策略。

机械诱导的生物电信号是骨物理微环境中的另一个重要组成部分[26], [27], [28]。在天然骨中，胶原纤维和矿物相在压缩和拉伸过程中发生压电极化并产生流动电位[29]。这些过程将生理机械活动（包括行走和肌肉收缩）转化为局部电位和电荷的变化[30], [31]。内源性电信号可以改变膜电位和离子分布，促进Ca2?内流，并激活钙调蛋白相关信号通路、整合素/FAK、MAPK/ERK、Wnt/β-catenin和BMP/Smad通路[32], [33], [34]。这些反应可增加Runt相关转录因子2（RUNX2）、碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）的表达，并支持间充质干细胞迁移、成骨分化和矿化基质形成[35], [36], [37]。骨缺损破坏了天然的胶原-矿物结构和其连续的机电耦合网络，限制了生理载荷下有效且持续的电学信号的生成[38], [39]。传统电刺激通常依赖于外部电极、电源或导线，这增加了系统复杂性，并可能在长期植入过程中产生不均匀的局部电场或引发安全问题[40], [41]。压电材料在机械变形下发生极化并产生表面电荷，可以利用日常运动、组织变形或超声的机械能量在体内产生动态电信号，而无需植入电池[42]。将这些材料掺入水凝胶网络中，可以使柔性基质将外部施加的机械能转化为电信号[43]。因此，机械响应的压电水凝胶可能为重建局部力学-电学信号和支持骨修复相关的细胞过程提供了一条可行途径。

尽管压电水凝胶在骨组织工程领域引起了越来越多的关注，但现有设计主要强调机电转换和电学介导的细胞刺激，而基质粘弹性的调控作用受到的关注相对较少[44]。这代表了一个重要的空白，因为应力松弛和能量耗散可以直接影响细胞铺展、迁移、细胞骨架重塑和成骨分化[45]。因此，将动态基质粘弹性与机械激活的压电刺激整合到单一水凝胶中，可能为再现骨微环境的物理信号提供更全面的策略。

在本研究中，我们开发了一种超声响应的粘弹性压电复合水凝胶PVE-Gel，旨在再现骨微环境的部分力学和电学特征（图1）。甲基丙烯酸酯明胶（GelMA）作为光交联主网络。掺入醛基功能化甲基丙烯酰化透明质酸（OHAMA），其醛基与GelMA链上的残余胺基形成可逆席夫碱键。这些动态接头嵌入在稳定的共价网络中，赋予应力松弛、可逆形变和机械能量耗散。然后将钛酸钡（BaTiO?，BTO）纳米颗粒分散在整个水凝胶网络中，使其在超声刺激下能够极化并原位产生电信号。我们表征了复合水凝胶的流变学和力学性能、降解、溶胀和压电输出。随后，我们在体外检测了BMSCs的活力、铺展、迁移、细胞骨架组织和成骨分化。还评估了巨噬细胞标志物表达以及CXCL12、CXCR4和成骨蛋白的表达，以表征水凝胶条件下的额外细胞反应。总之，这些实验评估了细胞对结合了基质粘弹性和超声诱导压电刺激的水凝胶的反应，并为设计旨在调节力学-电学微环境以用于骨修复的生物材料提供了参考。

方法节选 甲基丙烯酸酯明胶的合成：将20 g明胶在pH 9的碳酸缓冲液200 mL中溶解，于50 °C下搅拌。溶液避光保存，使用注射泵以0.2 mL/min的速率加入2 mL甲基丙烯酸酐（MA）。反应进行3小时，加入100 mL磷酸盐缓冲液（PBS）终止反应。反应混合物在7000 rpm离心15分钟以去除未反应的MA。所得溶液转移至分子量为…的透析袋中。

BTO的压电力显微镜检测：将BTO粉末研磨以获得均匀样品，压制成扁平样品，并使用导电胶固定于导电基底上。使用原子力显微镜以接触模式检测样品，选择具有稳定颗粒分布的相对平坦区域进行分析。导电探针与样品表面接触，施加交流电压以获取PFM幅值和相位图像。施加正负直流偏置…

BMSC培养及水凝胶和超声处理：骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养于补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的α-最小必需培养基（α-MEM）中，在37 °C、5% CO?的湿化培养箱中维持。当细胞达到70%汇合度时开始实验处理。实验中评估水凝胶和超声对BMSCs活力影响时，使用40 kHz超声作为外部机械刺激。

BMSCs的活/死染色：BMSC活力通过…检测。

统计分析：所有定量数据以均值±标准差（SD）表示。使用GraphPad Prism进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验。P < 0.05被认为具有统计学意义。每项定量实验的确切样本量（n）在相应图例中注明。

仿生粘弹性压电水凝胶的制备与表征：天然骨组织细胞外基质不仅为细胞提供结构支撑，还通过粘弹性变形和压电信号参与骨稳态和再生的调节[46]。基于此原理，以GelMA作为基底网络，掺入粘弹性水凝胶构建VE-Gel，并添加BTO纳米颗粒制备PVE-Gel，旨在建立一个兼具粘弹性和…的物理微环境。

结论 材料表征和体外细胞实验表明，PVE-Gel将基质粘弹性与超声响应性压电特性相结合。粘弹性网络降低了水凝胶的初始刚度并增强了其形变和能量耗散特性，而BTO使水凝胶在超声刺激下能够产生周期性电信号。体外实验显示，超声刺激的PVE-Gel增强了BMSCs的铺展和迁移，提高了RUNX2和OCN…

CRediT作者贡献声明 张怡：撰写—审阅与编辑、项目管理。王超：撰写—初稿、调查研究、数据整理。张崇靖：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、项目管理。郑伟：可视化。庄燕：方法论、调查研究。张明伟：资源、概念构思。徐扬凯：监督、软件。黄少辉：撰写—初稿、方法论、调查研究

利益冲突声明 作者声明没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本研究中报告的工作。

数据可用性声明 通讯和材料请求应发至通讯作者。评估本文结论所需的所有数据均在本文和补充信息中。与本论文相关的额外数据可向作者索取。

利益冲突声明 ? 作者声明没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本研究中报告的工作。

致谢 感谢所有参与本研究的人士以及为我们提供资助的机构。福建省自然科学基金（2024J01760、2025J08207和2025J0112）。福建省科技创新联合基金（2025Y9555）。

黄少辉 | 庄燕 | 郑伟 | 徐扬凯 | 张明伟 | 王超 | 张怡 | 张崇靖 福建中医药大学附属人民医院骨科，福州，350003，中国