基于三唑并三嗪骨架的选择性A3腺苷受体拮抗剂：从分子识别到神经保护

《ChemMedChem》：Tuning the Triazolotriazine Scaffold Toward Selective A3 Adenosine Receptor Antagonists: From Molecular Recognition to Neuroprotection

　　

为发现选择性A₃腺苷受体（A₃ AR）拮抗剂，研究人员开发了一系列2,5,7-三取代[1,2,4]三唑并[1,5-a][1,3,5]三嗪（TTs）。在既往构效关系（SAR）研究指导下，将C2-呋喃基取代基替换为苯基或4-甲氧基苯基，以提高A₃ AR亲和力与选择性。C2位苯基取代与适当的C5、C7氨基取代基共同对受体识别产生关键调节作用。尤其，C5位苄氨基取代显著增强A₃ AR亲和力，得到本系列中活性最强的拮抗剂化合物15（K_i=0.485 nM）；而C2位引入4-甲氧基苯基则大幅提高亚型选择性，以化合物30为代表（对A₃ AR选择性>2800倍）。基于近期解析的A₃ AR拮抗剂结合态结构进行的分子对接合理化了上述趋势，并确定了决定A₃ AR偏好的关键结构要素。研究人员在大鼠海马脑片氧-葡萄糖剥夺（OGD）模型中考察了A₃ AR阻断的生物学意义。化合物15延迟了缺氧去极化（AD），且在缺血期间给药时可阻止大多数脑片AD的发生，并促进突触传递近完全恢复。这些结果确定TT衍生物是有前景且高选择性的A₃ AR拮抗剂，在脑缺血中具有潜在神经保护应用。

研究背景与目的：细胞外腺苷是发挥局部细胞保护作用的天然调节分子，通过四种G蛋白偶联受体（GPCR）亚型A₁、A_2A、A_2B、A₃腺苷受体（AR）介导效应。A₃ AR参与炎症、慢性疼痛、肿瘤和脑缺血等病理过程；缺血时细胞外腺苷蓄积可激活这一低亲和力受体，而选择性A₃ AR拮抗剂在氧-葡萄糖剥夺（OGD）模型中能延迟缺氧去极化（AD）并减轻缺血性神经元功能障碍。此前，含2-呋喃基的[1,2,4]三唑并[1,5-a][1,3,5]三嗪（TT）衍生物虽对AR有活性，但对A₃ AR的亲和力与亚型选择性仍不理想。本研究借鉴其他骨架中将呋喃基替换为苯基可提高A₃ AR选择性的经验，系统考察TT骨架C2、C5、C7取代基对人A₃ AR（hA₃ AR）亲和力与选择性的影响，并评估先导化合物在脑缺血体外模型中的神经保护潜力。

研究人员设计并合成了30个2,5,7-三取代TT化合物。关键技术方法如下：以2,4,6-三氯三嗪为原料，经取代、环化和两次亲核芳香取代得到目标化合物；采用稳定表达人A₁、A_2A、A₃ AR的CHO细胞进行放射性配体竞争结合实验（[³H]CCPA、[³H]NECA、[³H]HEMADO），并以腺苷酸环化酶活性抑制实验测定hA_2B AR活性；利用A₁（PDB: 5N2S）、A_2A（PDB: 5NM4）、A₃（PDB: 9EHS）的拮抗剂结合态结构进行GOLD/ChemScore分子对接与MOE诱导契合精修；在雄性Wistar大鼠海马脑片OGD模型上记录场兴奋性突触后电位（fEPSP）与AD。

2.2.1 hA₁、hA_2A、hA_2B受体上的总体趋势：所有化合物在测试浓度范围内对hA_2B AR无可测亲和力；对hA₁ AR整体亲和力较低，其中2-(4-甲氧基苯基)衍生物最弱。化合物19、11和10为hA₁ AR亲和力最高者（K_i=58.2、77.8、104 nM），并同时具有较好的hA_2A AR亲和力（29.1、9.15、35.5 nM）。

2.2.2 C2取代对hA₃ AR亲和力与选择性的影响：将C2位呋喃基替换为苯基或4-甲氧基苯基显著改善hA₃ AR选择性。在C7-苄氨基、C5-苯氧基系列中，hA₃ AR选择性顺序为呋喃基<苯基<4-甲氧基苯基。5,7-双(苄氨基)衍生物中，化合物30选择性最高（对hA₁和hA_2A均>2874倍；K_i=34.8 nM）。化合物28（C2:4-甲氧基苯基；C7氨基；C5苄氨基）对hA₁选择性>60606倍、对hA_2A为301倍，K_i=1.65 nM；化合物11（C2:苯基）K_i=5.05 nM，较其2-呋喃类似物提高6倍以上。

2.2.3 C5取代对hA₃ AR结合亲和力的影响：在C7-甲氨基系列中，C5取代基对hA₃ AR亲和力的增强顺序为甲氨基<环丙氨基<苯氧基<环己氨基<苄氨基。引入C5-苄氨基得到本系列最强hA₃ AR拮抗剂化合物15（K_i=0.485 nM）；化合物19（C7环丙氨基）和11（C7氨基）也分别达到0.803和5.05 nM。

2.2.4 C7取代对hA₃ AR选择性的影响：在2-苯基系列中，C7-甲氨基赋予突出选择性：化合物2（K_i=10.6 nM）对hA₁选择性>9434倍、对hA_2A选择性135倍；化合物15对hA₁和hA_2A的选择性分别为779和205倍。C7-环己氨基的化合物23对hA₁和hA_2A选择性均>633倍。

2.3 分子模拟：基于实验解析的拮抗剂结合态结构进行分子对接。在hA₃ AR，TT核心通过Asn250氢键和Phe168π-π堆积锚定，C2与C5芳基可在结合腔深部和外区间形成两种能量接近的结合模式；C7疏水取代基与hA₃ AR特有的Val169和Ile253形成疏水接触，而hA_2A AR的Glu169-His264盐桥阻碍了C7取代衍生物采用ZM 241385样结合模式，这与C7取代后hA_2A亲和力下降一致。静态对接不足以区分两种结合模式，需要分子动力学模拟与构象约束类似物进一步研究。

2.4 OGD体外研究：在30 min OGD中，10 nM化合物15将AD出现时间由5.87±0.31 min显著延后至8.25±0.33 min，AD幅度无显著变化，且不改变基础突触传递。在7 min OGD中，对照脑片发生不可逆突触传递丧失；若仅在OGD最后3 min及复氧后5 min给予10 nM化合物15，可阻止4/5脑片AD发生，在这些脑片中fEPSP于OGD后30 min恢复至基线99.0%±3.5%。由于A₁阻断会增加fEPSP，而10 nM化合物15不足以结合A_2A AR（hA_2A K_i=99.3 nM），该保护作用归因于A₃ AR阻断。

讨论部分将构效关系与分子识别联系起来：C5-苄氨基的亲和力增益可能源于与TM7 Tyr265的额外疏水/芳香接触；C2芳基与C5苄氨基可在结合腔内互换位置，故两种结合模式均与该残基相互作用。hA₃ AR结合腔入口的疏水残基Val169/Ile253和更宽敞的底部（Ser181/Ser247）解释了本系列对hA₃ AR的偏好；hA_2A AR的Glu169-His264盐桥则限制了大体积C7取代。结果支持TT骨架可作为高选择性hA₃ AR拮抗剂的平台。

结论部分：本研究设计并合成了一系列2,5,7-三取代[1,2,4]三唑并[1,5-a][1,3,5]三嗪，考察了将经典C2-呋喃基替换为苯基和4-甲氧基苯基的影响。系统SAR分析表明，C2、C5、C7取代基的调节深刻影响对人腺苷受体各亚型的亲和力与选择性。其中化合物15是系列中最强效的hA₃ AR配体（K_i=0.485 nM），并对其他亚型表现出优异选择性；化合物30选择性最高，对hA₃ AR相对hA₁/hA_2A超过2800倍。分子对接为上述特征提供了一致解释。化合物15在OGD海马脑片模型中延迟AD、明显保护缺血后的突触功能，提示这类新型hA₃ AR拮抗剂兼具效价、选择性和神经保护活性，为脑缺血及其他hA₃ AR相关疾病的治疗策略提供了有前景的先导化合物。