优化临床宏基因组学中的病原体检测：针对单端短读长的生物信息学流程的全面基准测试

《The Journal of Molecular Diagnostics》：Optimizing Pathogen Detection in Clinical Metagenomics: A Comprehensive Benchmarking of Bioinformatic Pipelines for Single-End Short Reads

　　

摘要

用于病原体识别的宏基因组新一代测序（mNGS）技术已越来越多地被用作诊断工具。以往的研究主要强调选择基于大于100bp reads的分类软件，而忽视了测序数据预处理和后处理阶段的影响。本研究对宏基因组分析流程中使用的各个阶段工具进行了独立评估，这些阶段包括质量控制、宿主reads去除、分类学分类和假阳性去除，所用数据来源于对13个阳性对照模拟群落样本进行测序所得的单端50bp reads。采用不同湿实验方法处理相同模拟样本所得的单端50bp数据评估了工具组合的效能。结果表明，质量控制和宿主去除技术的选择至关重要，显著影响从临床宏基因组测序数据中提取微生物reads的效果，并导致α多样性升高。虽然假阳性过滤在不影响召回率的情况下提高了基于修剪工具组合的精确率，但在使用bt2比对器的组合中效果有限。本研究的工具组合流程整合了针对四类微生物的不同假阳性方法：细菌不进行过滤、真菌使用bracken、DNA病毒使用相对丰度（>0.1%）、RNA病毒使用z-score（z > 3）进行鉴定，并将其实施于先前用于未来基准测试的R Shiny应用程序中。本研究强调了预处理和分类器选择在准确宏基因组病原体识别中的关键作用。

引言

感染性疾病是导致死亡的重要原因之一，尤其在免疫功能低下的人群中¹。快速、准确的病原体识别对于感染性疾病的管理至关重要。与传统诊断方法（如微生物分离培养、靶向PCR和血清学技术）不同，宏基因组测序提供了一种全面、快速、无需培养且无偏的方法，理论上可以在单次检测中识别样本中存在的所有微生物2, 3。宏基因组测序的应用正在从研究领域向临床领域转移⁴。

在病原体识别检测中，重点是检测病原微生物，同时平衡成本、速度和准确性。这些检测通常使用50–100 bp的单端reads，每个样本产生约1000万–2000万条reads，结果在20小时内得出。相比之下，微生物组研究通常使用150 bp的双端reads⁵。两者标准的分析步骤包括过滤低质量reads、去除宿主DNA以及对剩余reads进行分类。常用工具包括用于质量控制的Trimmomatic、用于比对的Bowtie2以及用于分类的MetaPhlAn4⁶。其性能通常使用150 bp双端测序数据进行评估，例如来自CAMI2数据集⁷或Szóstak等人测序的肠道微生物全细胞混合物的数据，后者产生了约1000万条150 bp双端reads⁸。

临床和独立的第三方实验室越来越多地开发内部生物信息学流程用于基于mNGS的病原体检测⁹，同时也出现了多个公开可用的流程。其中包括交互式平台，如RpNGS¹⁰、UltraSEQ¹¹和IDseq¹²，以及计算流程如Kraken系列¹³、SURPI+¹⁴和PAIPIine¹⁵。然而，标准化工作流的缺失导致各实验室在工具选择和数据预处理步骤上存在显著差异。

质量控制步骤可能包括接头修剪、去重复和过滤低质量或低复杂度reads，但这些步骤的实施并不一致。例如，SURPI+不去除重复reads，而UltraSEQ缺乏低复杂度过滤。用于减少假阳性的后处理方法也差异很大，包括RPM-ratio过滤16, 17、基于z-score的指标以及源自内部验证研究的固定每2000万reads（RPTM）截断值⁹。甚至在Kraken系列等某些工作流中，宿主去除也是可选步骤。

由于阳性计算机模拟数据集无法反映湿实验的变异性，模拟微生物群落对于在现实条件下评估工具性能至关重要。大多数先前的评估仅聚焦于单一微生物群体（病毒或细菌）¹⁸。近期开发的混合微生物参考材料含有细菌、病毒、真菌和人类DNA19, 20，使得对临床mNGS流程进行全面基准测试成为可能。

本研究系统评估了16种常用工具在主要数据处理步骤中的综合效应，利用模拟微生物mNGS数据集生成243种用于病原体检测的流程组合。通过评估质量修剪、宿主reads去除、分类学分类和假阳性过滤，以相对于已知真实值（ground-truth）微生物的表现为标准进行量化。最佳工具组合进一步使用不同湿实验方案独立生成的数据集进行验证。随着新模拟材料和更新工具的不断出现，这些结果为选择有效的流程组件提供了框架。最佳工作流已被纳入R Shiny应用程序中，以便进行高效的基准测试并便于未来整合额外的数据集和工具。

章节片段

参考面板和测序

作为宏基因组测序（mNGS）综合多中心质量评估研究的参与者¹⁹，本研究获得了13个模拟微生物群落样本和一个阴性对照。微生物群落中的细菌和真菌使用一次性无菌棉签从相应的培养板中收集，通过与无菌生理盐水（0.9% w/v NaCl）混合制备微生物悬液。RNA病毒、DNA病毒和细菌真菌的核酸提取使用QIAamp viral

结果

为了解释宏基因组新一代测序数据，需要进行若干分析步骤——质量控制、宿主reads去除和分类学分类28, 29。尽管每个步骤都有大量可用工具，但先前的基准测试通常仅关注单一组件以及较长的短reads数据（100–150 bp）30, 31, 32。此处对16种前后处理工具进行了比较，并利用20小时临床测序策略评估了其对病原体检测的影响

讨论

使用模拟微生物数据集评估了各宏基因组处理步骤中常用工具的性能，并分析了243种用于病原体检测的工具组合。使用不同实验室操作和测序仪对相同样本进行验证表明，分类器选择和预处理方法对分类准确性、敏感性和多样性有显著影响。假阳性去除应根据微生物类型进行调整。表现最佳的32线程工具组合为

结论

本研究证明预处理和分类器选择对于准确的宏基因组病原体检测至关重要。Fastp提高了测序质量并减少了未比对reads，而Fastp–BBMap–Kraken2Uniq组合取得了最高精确率。修剪和比对在几乎不影响真实微生物丰度的情况下最大限度地减少了假阳性。针对细菌、DNA病毒、真菌和RNA病毒整合多种假阳性过滤器进一步提高了精确率。这些优化的

作者贡献

马军（方法论-同等贡献，软件-支持，撰写——原稿-同等贡献），郝婷（方法论-同等贡献，软件-主要），白亚红（调查研究-主要），小磊（方法论-同等贡献），杨倩倩（调查研究-支持），戴鹏高（经费获取-同等贡献，撰写——审阅与编辑-同等贡献）和王惠娟（概念构思-主要，撰写——审阅与编辑-同等贡献）。

利益冲突

郝婷、杨倩倩、戴鹏高、王惠娟和马军就职于陕西丽丰公司。白亚红和小磊就职于大西安地区医学诊断实验室中心。作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢国家临床检验中心提供平台以评估病原体宏基因组检测方法。

马军|郝婷|白亚红|小磊|杨倩倩|戴鹏高|王惠娟