《Clinical & Translational Immunology》：From delivery to integration: CRISPR-mediated large insert gene editing in primary human T cells
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在离体（ex vivo）原代人T细胞中进行大片段插入基因编辑，是工程化下一代细胞免疫疗法的重要策略。尽管基于CRISPR的编辑在小规模遗传修饰中已较为成熟，大片段插入敲入仍是技术瓶颈。本综述考察实现大遗传元件高效、精准且安全整合的现有策略。研究人员比较CRIS
在离体（ex vivo）原代人T细胞中进行大片段插入基因编辑，是工程化下一代细胞免疫疗法的重要策略。尽管基于CRISPR的编辑在小规模遗传修饰中已较为成熟，大片段插入敲入仍是技术瓶颈。本综述考察实现大遗传元件高效、精准且安全整合的现有策略。研究人员比较CRISPR组分的递送方法，强调Cas9核糖核蛋白（RNP）电穿孔是最有效但常具细胞毒性的方法；细胞穿透肽（CPP）和脂质纳米颗粒（LNP）等新兴替代方案可改善细胞活力，但以编辑效率为代价。评估基因组位点选择、引导RNA（gRNA）设计和染色质背景对编辑结果的影响，以及同源定向修复（HDR）模板设计的作用。评估多种模板形式——包括线性双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）、质粒、环状单链（css）DNA和重组腺相关病毒（rAAV）——的效率、毒性和脱靶整合风险。在可能情况下，采用跨研究标准化以实现有意义的比较。rAAV模板持续获得最高插入率，但存在成本、大小限制和插入突变担忧；非病毒方法如cssDNA模板则显示前景。此外，研究人员综述小分子调节剂增强HDR效率，指出提高插入率与潜在基因组不稳定性之间的权衡。总体而言，成功的大片段插入编辑需要平衡编辑效率、细胞活力和基因组安全性。持续优化递送系统、模板设计和修复通路调控，对推进可扩展且临床可行的T细胞疗法至关重要。
引言（Introduction）
利用CRISPR在原代人T细胞中可将大DNA片段（定义为>500 bp）精准整合，从而工程化功能更优、持久性更强的细胞免疫治疗。传统基因编辑多利于小DNA编辑，若克服限制，大片段T细胞编辑可构建复杂细胞设计。本综述探讨离体（ex vivo）原代人T细胞中高效、安全、稳定整合大DNA片段的策略与挑战，并比较CRISPR介导编辑方法和同源定向修复（HDR）模板设计。
T细胞作为免疫治疗（T cells as an immunotherapy）
T细胞是适应性免疫关键，可杀伤癌或病毒感染细胞，已用于细胞免疫治疗。首个此类疗法2017年获美国FDA批准治疗儿童急性淋巴细胞白血病，后续批准用于非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤等血液癌。治疗成功依赖T细胞受体识别肿瘤抗原。受体可为天然或替换的T细胞受体（TCR；TCR-T细胞），如肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）表达者，或工程化嵌合抗原受体（CAR；CAR-T细胞）。CAR含抗体来源识别序列融合TCR信号域。传统上受体DNA通过逆转录病毒或慢病毒递送，但存在插入拷贝数可变、TCR链错配、插入突变和继发癌症风险。精准插入内源TCR启动子下游可动态调控表达，改善抗肿瘤活性。CRISPR/Cas递送可解决部分问题，但大片段编辑仍面临高毒性和低插入率。本综述关注编辑机器递送、修复模板类型和HDR增强剂优化。
CRISPR/Cas9编辑系统
CRISPR最初为细菌病毒防御系统。gRNA引导Cas蛋白结合互补病毒序列并造成DNA断裂，切割依赖原间隔序列邻近基序（PAM）。哺乳动物编辑常用化脓性链球菌SpCas9。Cas9在gRNA引导下产生双链DNA断裂（DSB），由非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）竞争修复；NHEJ产生插入/缺失（indels），HDR需HDR模板（HDRT）并允许插入不同长度DNA，但插入率通常随插入和模板长度增加而降低。AsCas12a等替代Cas产生不同切割和PAM；碱基编辑器避免DSB但多限于单碱基改变；先导编辑可大插入但原代人T细胞应用有限。本综述聚焦Cas9介导大片段编辑。跨研究比较受编辑方案、插入大小、同源臂长度和靶位点差异影响。
编辑机器的递送（Delivery of the editing machinery）
电转（Electroporation）：原代人T细胞中核酸酶和gRNA几乎均通过电穿孔Cas9核糖核蛋白（RNP）或mRNA递送，核内存在短暂，限制脱靶或再切割。聚L-谷氨酸（PGA）和非同源单链DNA增强剂可防止RNP聚集，提高活力和HDR率，但PGA可能小幅增加脱靶切割。
细胞穿透肽与脂质纳米颗粒：电转可改变激活、耗竭和毒性相关基因表达。细胞穿透肽（CPP）如PERC通过HIV-1 TAT和流感HA2肽递送Cas9，对转录组影响小；脂质纳米颗粒（LNP）也可减少有害转录组变化并保留记忆表型。但二者DNA切割低于电转。CPP加dsDNA HDRT会降低切割，可用rAAV HDRT绕过；LNP在T细胞HDR也仅用rAAV递送HDRT。
位点依赖性效应（Locus-dependent effects）
位点依赖性编辑效率：Cas9结合和DSB产生呈序列和位点依赖。GC含量、染色质状态和靶基因功能影响切割和HDR。40–60% GC、PAM近端（距PAM 1–12个核苷酸）低于56% GC、PAM远端高于50% GC较优。靶位点受PAM限制（Cas9 NGG；AsCas12a TTTV），相同序列gRNA在不同位点切割效率不同，可能因染色质和DNA甲基化。靶向必需基因GADPH并带恢复序列和GOI的HDRT可选择HDR细胞，>90%群体含预期编辑，但插入基因受靶位点启动子控制。
位点依赖性功能效应：插入TRAC可敲除天然TCR，提高安全性和减少TCR链错配；TRAC、AAVS1、ROSA26和CLYBL为安全港位点。TRAC插入还通过内源动态调节延迟效应T细胞分化和耗竭，改善抗肿瘤活性。TET2位点随机插入曾促进中央记忆表型，提示位点影响表型和功能。
同源定向修复的模板设计（Template design for homology-directed repair）
优化模板设计对大片段编辑关键。策略包括：向内源表达基因引入新组件，如TCR重定向；向已有位点引入全新基因并敲除内源基因，如CAR-T生成；或用恢复完整内源基因加插入的模板，但增加HDRT大小；较少用带启动子的GOI插入。
模板结构：HDRT结构影响HDR率、毒性和脱靶插入。
线性dsDNA：常用于T细胞，易制备且便宜，但毒性随长度增加，因cGAS-STING识别胞质DNA。较短模板可高浓度使用。化学修饰如链间交联可提高HDR；截短Cas9靶序列（tCTS）促进入核并提高HDR。线性dsDNA易随机整合，且DNA末端可激活ATM相关凋亡。
线性ssDNA：线性单链DNA（lssDNA）毒性低于dsDNA，脱靶整合较少但靶向整合也较低；活力高可提高模板量，增加编辑细胞总产量。制备需防dsDNA污染。tCTS用于ssDNA需杂合dsDNA/ssDNA构建体，可提高HDR率和活力。
环状DNA：环状双链DNA如质粒易生产，但原代人T细胞应用受大小毒性限制。Cas9切割序列（CCS）可线性化质粒并提高HDR，但质粒HDR仍较低。纳米质粒和pMini骨架更小；纳米质粒比pUC57和线性dsDNA提高活力和编辑产量。环状单链DNA（cssDNA）结合ssDNA和环状模板优势，在细胞系、造血干细胞和原代人T细胞中HDR率高于线性ssDNA和环状dsDNA；与结合单链DNA的Cas9联用可增强，但数据有限。
AAV：重组腺相关病毒（rAAV）HDRT可高率插入大货物，通过病毒运输直接入核。其结构类似线性ssDNA，但含反向末端重复（ITR）。同源臂约500–700 bp常用，~550–600 bp可达高编辑率。rAAV容量约4.7 kb；多重编辑可插入6.5 kb基因盒。rAAV通常非整合，但可非同源整合，且附加体持久存在增加脱靶风险；已有AAV插入PLAG1相关肿瘤案例。同源臂长度约400–800 bp对HDR率影响不显著；过长达1600 bp无进一步收益且毒性增加。
小分子抑制剂（Small-molecule inhibitors）
NHEJ和HDR竞争。DNA蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）抑制剂M3814、NU7441可提高HDR，但AZD7648与kb至Mb缺失、染色体臂丢失和易位相关。DNA聚合酶θ（Pol θ）介导的θ介导末端连接（TMEJ）抑制与DNA-PK抑制有相加效应。组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂TSA开放染色质提高HDR，但毒性及表型影响限制使用。细胞周期抑制剂XL413同步细胞于S/G
2期提高HDR，但减少总细胞数。联合M3814、TSA和XL413可在不同位点提高HDR，最高约90%，但安全性分析有限。
结论（Conclusion）
原代人T细胞大片段编辑有望开发更安全有效的细胞免疫治疗。rAAV HDRT提供最高已知编辑率，但成本、制造和附加体持久性限制；非病毒最佳策略可能是Cas9 RNP与cssDNA HDRT共电转，但数据有限。tCTS在多种模板中有前景。未来需系统比较HDR策略、优化模板设计并阐明整合机制。PASTE、PASSIGE、PRIME-in和QUAD-PE等先导编辑系统避免dsDNA断裂，可能取代CRISPR/Cas9介导编辑。
