CAR-T细胞疗法的演进：功能工程、制造创新、替代细胞来源与体内CAR编程策略

《Cancer Science》：Evolution of CAR-T Therapy: Functional Engineering, Manufacturing Innovation, and Future In Vivo Strategies

　　

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已改变血液系统恶性肿瘤的治疗，并为工程化细胞免疫治疗建立了新范式。然而，其更广泛的临床应用仍受限于复杂的自体制造、高成本、有限的可扩展性、产品质量可变、实体瘤疗效欠佳以及治疗相关毒性。为应对这些挑战，近期CAR-T细胞疗法的进展可从四个相互关联的维度进行审视：功能工程、制造创新、替代细胞来源和体内CAR编程。功能工程包括细胞因子装甲、检查点抵抗、多靶点和模块化或可切换CAR平台，旨在增强疗效、持久性和安全性。与此同时，制造创新如缩短培养方案、自动化封闭系统和保留分化程度较低的T细胞状态，旨在提高产品效力，同时减少生产时间和复杂性。替代细胞来源，包括同种异体供者来源和诱导多能干细胞（iPSC）衍生平台，可能进一步实现标准化、可扩展且潜在“即用型”疗法。最后，体内CAR编程已作为第四个维度出现，其中内源性免疫细胞在患者体内直接使用病毒或非病毒基因递送系统进行工程化。该综述总结这些相互关联的进展，并讨论它们如何共同塑造下一代基于CAR的免疫疗法。

1 Introduction
过去十年，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已成为过继细胞免疫治疗中最成功的形式之一，在难治性血液恶性肿瘤中取得前所未有的临床反应。自体CD19靶向CAR-T产品在复发或难治性B细胞白血病和淋巴瘤中诱导持久缓解，后续CAR疗法将获益扩展至多发性骨髓瘤。尽管如此，实体瘤转化受限于运输、抗原异质性、物理基质屏障和高度免疫抑制肿瘤微环境；治疗相关毒性包括细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）和靶向非肿瘤效应；常规CAR-T还依赖个体化自体制造流程，需白细胞分离、体外T细胞激活、基因转移、扩增、质量检测和回输，耗时数周、成本高，且延长体外培养可促T细胞分化与耗竭，损害回输后增殖能力、持久性和抗肿瘤疗效。作者从四个相互关联维度审视CAR-T疗法演进：功能工程、制造创新、替代细胞来源和体内CAR编程。这些维度解决不同障碍，可能沿不同但交叉路径发展。

2 Functional and Manufacturing Evolution of Ex Vivo CAR-T Cell Therapy
2.1 Cytokine-Armored CAR-T Cells: From Concept to Clinical Translation
常规CAR-T在血液肿瘤中变革了结局，但持久性有限、慢性抗原暴露下功能障碍和免疫抑制微环境仍限制疗效，尤其实体瘤。装甲CAR-T通过引入免疫调节载荷增强内在T细胞适应或重塑免疫环境。细胞因子装甲是临床进展最突出者之一，可促进CAR-T持久性、招募内源免疫细胞和重塑肿瘤微环境。IL-12提供早期概念验证，但临床经验提示仅激活响应表达不足以限制暴露，当前IL-12工程更强调空间或激活依赖控制，包括抗原诱导和膜锚定格式。IL-15支持记忆CD8⁺ T细胞和NK细胞，系连IL-15在临床前延长持久性并富集干细胞记忆样亚群。I期研究中，IL-15装甲GPC3靶向CAR-T较非装甲产品体内扩增更强，客观缓解率（ORR）为33%、疾病控制率（DCR）为66%；但需免疫调节治疗的CRS更频繁，内置安全机制具有潜在价值。IL-7/CCL19装甲模拟次级淋巴组织T细胞区，结合IL-7支持转移CAR-T存活与CCL19招募内源T细胞和树突状细胞，也称PRIME CAR-T；在免疫健全同源模型中诱导肿瘤完全消退并伴内源免疫细胞浸润，后续研究显示表位扩展，并在多种实体瘤模型中显示抗肿瘤活性。早期临床研究中，39例复发或难治大B细胞淋巴瘤接受CD19靶向、可诱导IL-7/CCL19表达CAR-T，3个月ORR为79.5%，3级CRS和≥3级ICANS分别12.8%和10.3%；6例GPC3或间皮素阳性实体瘤初步队列中1例CR、1例PR、2例SD，无2-4级不良事件。其他策略包括CLDN18.2靶向共表达IL-7和XCL1的CAR-T、IL-18装甲等，均显示初步临床活性。总体，细胞因子装甲的核心权衡是增强扩增、持久性和肿瘤内免疫激活可改善抗肿瘤活性但增加全身炎症毒性；治疗窗可能取决于所选细胞因子及其表达方式，因此诱导或环境依赖载荷表达及补充安全机制重要。

2.2 Manufacturing Innovation as a Determinant of CAR-T Cell Quality and Accessibility
除CAR设计外，制造是CAR-T表型和功能的重要决定因素。常规自体生产包括白细胞分离、体外工程扩增和集中流程，静脉到静脉时间常超过数周。延长培养降低干性并促功能障碍或耗竭表型，可能限制体内扩增和持久性。为限制培养诱导分化并保留T细胞适应，当前制造策略包括富集na?ve、中央记忆或干细胞记忆亚群、缩短培养、基于IL-7/IL-15的细胞因子支持以及调节PI3K/AKT等分化相关通路。临床评估的加速制造平台包括T-Charge（YTB323和PHE885）、NEX-T（BMS-986354）和FasTCAR（GC007F和GC012F/AZD0120），制造时间分别不足2天、5-6天和约1天，同时限制T细胞分化。YTB323和BMS-986354使用与传统制造对应产品相同的CAR构建体，保留na?ve/干样或中央记忆表型，并以约25倍和10倍更低输注细胞剂量达到可比体内暴露。早期临床研究报告各疾病设置活性，支持加速制造临床可行性，但产品与适应症特异剂量和安全评估仍重要。缩短制造也开始与功能装甲融合：IL-18分泌huCART19-IL18采用3天制造；一项临床前研究将IL-7/CCL19装甲与约4天制造整合，省略转导后扩增阶段，保留记忆相关表型，在重复抗原刺激后维持功能，并在实体瘤模型中低细胞剂量介导抗肿瘤活性。同时，自动化通过封闭一体化平台和互操作模块化工作流推进，减少手工处理和变异性，可能支持集中高通量和分散点护理生产，但自动化工作流验证、适应性及跨制造地点一致质量控制仍是实施挑战。

3 Expansion of CAR-T Cell Sources: Allogeneic and iPSC-Derived Platforms
为克服自体CAR-T制造限制，使用健康供者来源同种异体CAR-T的标准化即用型平台已进入临床阶段。主要挑战包括移植物抗宿主病（GVHD）和宿主抗移植物排斥。基因组编辑主要用于建立同种异体兼容性，通过破坏内源T细胞受体（TCR）和修饰HLA相关通路实现；更新策略纳入免疫逃逸工程以提高持久性和抗宿主免疫，但广泛多重编辑引发基因组完整性和制造稳健性担忧。供者来源平台cema-cel、CTX110和ALLO-715在B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤中显示抗肿瘤活性，cema-cel进入关键II期评估。但持久性有限、宿主排斥、感染并发症和淋巴清除依赖仍是重要挑战。重复给药已有临床探索，CTX110两次输注方案显示改善缓解耐久性的信号，但重复给药能否补偿有限体内持久性仍不确定。诱导多能干细胞（iPSC）提供可再生、克隆定义的主细胞来源，可在免疫细胞分化前广泛工程化。FT819已从B细胞恶性肿瘤初步评估进展至自身免疫病临床开发；iPSC衍生CAR-NK产品FT596在B细胞淋巴瘤提供临床概念验证。健康供者来源CAR-T保留成熟T细胞生物学及已建立的效应和记忆程序，但受供者变异、宿主排斥和编辑成熟细胞复杂性影响；iPSC衍生平台对克隆选择、产品标准化和复杂工程控制更强，但面临分化、基因组稳定性、致瘤性和持久功能记忆生成等挑战。跨两类平台，下一代工程正超越基本同种异体兼容性向功能增强扩展，如破坏Regnase-1/TGFBR2和PD-1以增强细胞适应和抵抗免疫抑制信号。研究者团队临床前研究中，IL-7/CCL19装甲同种异体CAR-T促进表位扩展并增强抗肿瘤活性，提示免疫招募装甲在有限同种异体CAR-T持久性下维持抗肿瘤免疫的潜在作用。总体，供者来源和iPSC来源平台代表实现即用型CAR治疗的不同策略，持久性的相对重要性可能取决于治疗场景。

4 Toward In Vivo CAR Programming: Direct Engineering of Immune Cells in Patients
在制造创新和即用型细胞平台进展后，体内CAR编程已作为直接在患者内工程内源免疫细胞的策略出现。当前临床方法主要基于靶向整合慢病毒载体和非病毒mRNA-脂质纳米颗粒（LNP）系统。慢病毒载体可支持稳定基因转移和持续CAR表达，但可逆性有限且需考虑基因组整合；mRNA-LNP提供时间限制表达且无基因组整合。这些特性提出靶细胞选择性、载体免疫原性、效应持久性和给药策略等不同问题。靶向慢病毒载体旨在通过稳定基因转移产生扩增、潜在持久的CAR-T细胞。I期ESO-T01研究中，5例多发性骨髓瘤患者4例缓解，包括3例严格完全缓解；但所有5例发生≥3级不良事件，3例3级CRS，1例死于疾病相关脊髓压迫，研究提前停止。KLN-1010会议报告I期数据包括18例治疗患者，所有可评估患者报告缓解；CRS限于1-2级，ICANS发生在2例中包括1例3级，但中位随访仅2.8个月。JY231将慢病毒证据扩展至自身免疫病，16例难治性神经自身免疫病患者中体内CAR-T扩增伴完全B细胞清除和初步临床改善。这些研究支持慢病毒体内CAR-T编程可行性，但现有证据限于早期临床试验。对于mRNA-LNP平台，临床证据更早期，集中于快速、短暂编程的药效学证据。重复给药已纳入若干早期研究以更新CAR表达。B细胞恶性肿瘤中，GT801和WGb-0301给药后数小时内生成CAR表达T细胞并显示早期抗肿瘤活性，但反应数据有限。难治性系统性红斑狼疮患者中，HN2301通过mRNA-LNP递送生成CD19 CAR-T细胞并快速减少循环B细胞，3个月评估疾病活动降低。实体瘤中，MT-302体内编程TROP2靶向CAR髓系细胞，18例有靶病变评估者中1例确认部分缓解和7例疾病稳定；肿瘤内检测到CAR⁺髓系细胞和T细胞浸润增加，提供瘤内免疫编程早期证据。这些平台不同表达动力学可能影响炎症毒性时机。体内CAR-T的靶细胞选择性和生物分布仍是显著挑战：静脉LNP可蓄积于肝脏，慢病毒载体需使用重靶向包膜减少非T细胞转导。整合载体可维持CAR表达，但非预期细胞整合引发长期安全担忧，抗载体免疫可能限制递送或再给药；瞬时mRNA-LNP表达可能需重复给药，可能受递送载体免疫应答限制。展望未来，体内CAR编程可能日益纳入体外CAR-T研究开发的功能工程策略，多靶向已进入临床评估，如体内双靶点CAR方法LB2501；细胞因子装甲、调节信号和其他环境依赖程序可能是进一步方向，这些进展在实体瘤中可能尤其重要。

5 Conclusion and Future Perspectives
尽管常规自体CAR-T细胞疗法已显示变革性临床疗效，其更广泛应用仍受制造复杂性、成本、治疗延迟和实体瘤疗效有限限制。四个相互关联维度的进展——功能工程、制造创新、替代细胞来源和体内CAR编程——共同扩展了基于CAR治疗的范围和潜力。这些进展持续融合，连同基因组编辑和生物材料科学进步，可能将基于CAR的治疗从资源密集型、定制化细胞干预转变为更可扩展和可编程的治疗平台，适用于癌症和自身免疫病。