《Stem Cells International》：Fibrinogen Alpha Chain (FGA) Associates With Epithelial–Mesenchymal Transition, Stemness, and the USP–Catenin Complex in Colorectal Cancer
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背景：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的进展主要由上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）和癌症干细胞（cancer stem cell，CSC）特性的获得所驱动。阐明这些过程中特定的
背景：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的进展主要由上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）和癌症干细胞（cancer stem cell，CSC）特性的获得所驱动。阐明这些过程中特定的分子驱动因素和动态指标对于推进CRC诊疗至关重要。
方法：研究人员利用TCGA数据、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）以及配对的术前和术后血清样本评估了纤维蛋白原α链（fibrinogen alpha chain，FGA）的临床意义和诊断价值。通过Transwell实验和三维球体形成实验在HCT116细胞中评估了FGA的生物学功能。采用免疫沉淀-质谱联用（immunoprecipitation-mass spectrometry，IP-MS）和蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction，PPI）网络分析揭示潜在的分子机制。
结果：FGA的mRNA和蛋白在CRC组织中显著上调，初步数据显示CRC患者血清FGA升高。临床上，异常FGA表达与肿瘤组织学类型、淋巴浸润和不良生存结局相关。体外实验中，FGA过表达与E-钙黏蛋白下调、间充质标志物（波形蛋白Vimentin、ZEB1、Snail）上调以及细胞迁移和球体形成能力增强有关。机制上，IP-MS鉴定出一个潜在的PPI网络，其中FGA与泛素特异性蛋白酶（USP7、USP10）和连环蛋白复合体（β-连环蛋白、p120-连环蛋白）相关联，提示其在介导促干性信号中的潜在作用。
结论：这些发现表明FGA可能通过体外调节EMT和干性特征参与CRC的可塑性。此外，其术后动态降低值得进一步研究以确定其在非侵入性肿瘤监测中的应用价值。
论文解读文章
一、研究背景与目的
结直肠癌是全球最常见且致死率最高的恶性肿瘤之一，肿瘤转移和复发是导致患者死亡的主要原因，而这两个过程从根本上由上皮-间充质转化（EMT）和癌症干细胞（CSC）特性的获得所驱动。CSC是肿瘤中一小部分具有高度致瘤性、化疗耐药性的细胞亚群，被视为远处器官转移的“种子”。干性的动态调控涉及复杂的细胞内信号网络，其中最突出的是Wnt/β-连环蛋白通路，该通路在绝大多数CRC中被异常激活。该通路核心调控因子如β-连环蛋白的稳定性受到翻译后修饰的严格调控，泛素化通常靶向这些因子使其被蛋白酶体降解，而去泛素化则由泛素特异性蛋白酶（USP）介导，可挽救这些因子免于降解，从而维持恶性细胞可塑性并促进肿瘤进展。
纤维蛋白原α链（FGA）经典上被认为是凝血级联反应中的结构蛋白，与β链和γ链组装形成血纤蛋白基质，对止血至关重要。然而，越来越多的证据表明凝血系统与恶性肿瘤之间存在深层关联。凝血因子可外渗至肿瘤微环境（TME）并表现出多效性效应，参与细胞信号传导、细胞外基质重塑和肿瘤细胞存活。虽然CRC中由于癌症相关的高凝状态和急性期反应导致总血清或血浆纤维蛋白原升高已有充分记录，但FGA亚基作为血液生物标志物的特异性动态监测价值及其调控EMT和干性的细胞内分子相互作用组仍鲜有探索。鉴于对可靠的非侵入性诊断工具和转移驱动因素理解的迫切需求，研究FGA的功能角色具有高度的临床相关性。
近年来，CRC液体活检领域已显著扩展，超越了循环肿瘤DNA（ctDNA），涵盖了基于循环蛋白和细胞外囊泡（EV）的生物标志物发现。高通量蛋白质组学策略，特别是数据非依赖采集质谱（DIA-MS），已实现对血清和血浆的全面筛选，揭示了反映早期肿瘤动力学和微环境变化的多重蛋白特征。尽管这些高通量筛选和基于EV的平台为广泛的诊断特征发现提供了强大工具，但仍迫切需要分离并生物学验证特定、功能相关的蛋白枢纽。验证这些个体靶点不仅对于开发可及的、靶向的血清检测方法至关重要，而且对于理解驱动肿瘤进展的潜在机制也必不可少。
在本研究中，研究人员探讨了FGA在CRC中的双重临床和生物学作用。研究表明，除了其在凝血级联反应中公认的作用外，FGA似乎还作为EMT和癌症干性的调节因子发挥作用。此外，研究人员利用患者血清评估了其用于动态术后监测的潜力。进一步地，研究人员鉴定了一个潜在的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，其中FGA显示出与USP去泛素化酶和连环蛋白复合体的假定相互作用，可能影响CRC细胞中的促干性信号。
二、关键技术方法
- 1.
生物信息学分析：从TCGA数据库获取644例CRC患者的基因表达谱和临床病理数据，采用LASSO Cox回归分析评估总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展间期（PFI）。外部验证使用Kaplan-Meier Plotter数据库中1061例CRC患者的独立GEO微阵列数据集。
- 2.
组织与血清检测：通过免疫组织化学（IHC）评估配对正常和CRC肿瘤组织中的FGA蛋白水平。采用特异性针对FGA亚基的单克隆抗体的ELISA试剂盒，检测71例CRC患者（术前及术后7天）和47例健康对照者的血清FGA浓度，并进行受试者工作特征（ROC）曲线分析。
- 3.
体外功能实验：在HCT116细胞系中建立FGA过表达（FlagFGA）和敲低（ShFGA）模型，通过Western blot分析EMT标志物和干性标志物，利用Transwell实验评估细胞迁移能力，采用三维球体形成实验评估肿瘤干性。
- 4.
分子机制解析：通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）鉴定FGA相互作用蛋白，整合STRING公共数据库构建PPI网络。通过相互共免疫沉淀（Co-IP）验证FGA、USP10和β-连环蛋白之间的物理相互作用，并通过MG132处理和泛素化实验评估FGA的蛋白稳定性和泛素化水平。
三、研究结果
3.1 FGA在CRC中表达上调及其临床意义
研究发现，FGA mRNA在CRC肿瘤组织中的表达较正常组织显著上调。IHC染色在9个不同病例中证实FGA蛋白水平在CRC组织中显著升高。ROC曲线分析显示FGA区分肿瘤与正常组织的AUC为0.825。LASSO Cox回归分析表明包含FGA的特征在OS、DSS和PFI等多个生存结局中具有稳健的预后价值。
3.2 血清FGA水平升高及其在CRC中的诊断价值
CRC患者血清FGA水平显著高于健康对照组。配对样本分析显示，术后循环FGA水平较术前基线显著下降。ROC曲线分析显示，在该特定队列中血清FGA区分CRC患者与健康个体的AUC为0.977。但需强调，该初步分析仅比较了CRC患者与健康对照，未纳入良性结直肠腺瘤或炎症性肠病等临床相关疾病对照，因此其真正的疾病特异性尚无法确定。
3.3 FGA表达与CRC临床病理特征的关系
FGA高表达与标准腺癌比例较高显著相关，而黏液腺癌在低表达组更常见。FGA表达与淋巴浸润呈显著负相关。未观察到FGA表达与性别、年龄、BMI、术前CEA水平、治疗结局或TNM分期等其他变量间的显著相关性。在TCGA队列的多变量分析中，FGA并非OS的独立预后因素，但在包含1061例患者的大型外部GEO数据集中，高FGA表达与更差的OS、PPS和RFS显著相关。
3.4 FGA调控CRC细胞的EMT、迁移和干样特性
FGA过表达使上皮标志物E-钙黏蛋白下调，同时上调间充质标志物和核心干性因子，而FGA敲低则逆转了这一表型。Transwell实验显示FGA过表达增强细胞迁移能力，FGA敲低则显著抑制迁移。三维球体形成实验表明，FGA过表达促进更大更多肿瘤球体的形成，而FGA敲低则显著削弱球体形成能力。
3.5 IP-MS图谱鉴定FGA与USP去泛素化酶和连环蛋白复合体的假定相互作用
IP-MS分析揭示FGA与连环蛋白家族成员及黏附复合体分子存在强结合亲和力，包括p120-连环蛋白、γ-连环蛋白、β-连环蛋白和STAT3。同时，IP-MS数据捕获了多个USP家族成员，特别是已知能稳定β-连环蛋白的USP7和USP10。STRING数据库查询显示此前无FGA与连环蛋白/黏附复合体或USP家族之间功能或物理关联的记录，因此该IP-MS数据首次提供了CRC细胞中围绕FGA的全新、先前未表征的相互作用组的直接实验证据。MG132处理导致FGA时间依赖性累积，泛素化实验证实FGA发生广泛多聚泛素化。相互Co-IP实验验证了FGA、USP10和β-连环蛋白三者之间的物理空间关联。
四、讨论与结论
讨论总结：
研究人员在讨论中指出，FGA在CRC组织和血清中表达上调并与不良预后相关。血清FGA在术后显著降低，提示其作为动态、非侵入性生物标志物监测肿瘤状态的潜力，但由于FGA对围手术期因素敏感，这种降低提示与肿瘤切除的可能相关性而非确凿证据。FGA与特定内在肿瘤特征相关，独立于传统TNM分期和CEA水平。虽然在TCGA队列中FGA不是独立预后因素，但在更大的外部数据集中显示了更强的预后价值。血清FGA检测补充了基于EV和DIA-MS的高通量方法，提供了一种成本效益高、易于获取的动态术后监测指标。临床数据中高FGA与较低淋巴浸润相关而体外实验却显示FGA促进EMT和迁移这一看似矛盾的现象，反映了EMT的动态可逆性和肿瘤异质性。IP-MS揭示的新颖FGA相互作用组提示，FGA可能通过将USP与连环蛋白复合体关联，促进多聚泛素链去除，从而挽救促干性和EMT驱动因子免于蛋白酶体降解。研究人员承认需要进一步明确FGA的亚细胞定位和复杂组装的精确动力学，并指出诊断分析的局限性，包括缺乏临床疾病对照、未与现有筛查工具比较，以及体外实验仅使用单一细胞系且未进行通路特异性拯救实验。
结论翻译：
这项探索性研究表明，FGA在CRC组织和血清中过表达。虽然研究人员承认其作为急性期反应物参与系统性炎症的复杂作用，但初步发现提示其在动态术后监测中的潜在应用价值。体外实验中，FGA似乎通过调节EMT和干性参与肿瘤可塑性。此外，IP-MS数据产生了一个候选假说，即FGA与USP去泛素化酶和连环蛋白复合体存在假定相互作用，可能交叉作用于蛋白酶体降解通路。尽管这些发现凸显了FGA-USP-连环蛋白轴作为CRC有趣分子特征的价值，但仍需大量前瞻性临床验证和深入的机制研究来确认其真正的诊断特异性和治疗潜力。
