子宫内膜癌免疫微环境的假设生成性单细胞分析：TCGA-UCEC、独立肠道微生物组与RL95-2概念验证的多组学补充证据

《International Journal of Genomics》：Hypothesis-Generating Single-Cell Analysis of the Endometrial Cancer Immune Microenvironment With Complementary Multiomics Evidence

背景：子宫内膜癌（EC）具有异质性免疫微环境，且其与治疗反应相关的生物学仍未完全阐明。研究人员使用保留的EC单细胞数据集描述免疫细胞状态，并以TCGA-UCEC、独立肠道微生物组队列和RL95-2概念验证实验进行补充。由于每个临床反应组仅有一个样本，所有应答者与非应答者scRNA-seq比较均为描述性且用于生成假设。
方法：采用Scanpy、Leiden聚类及基于GO biological process、KEGG和MSigDB Hallmark基因集的过表征分析（ORA），使用Enrichr和Benjamini–Hochberg校正，分析接受抗–PD-1免疫治疗EC患者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GEO: GSE251923；一个应答者，GSM7990051，和一个非应答者，GSM7990052；质量控制后保留17,546个细胞）。TCGA-UCEC的bulk RNA-seq（554个肿瘤和35个正常样本）用于补充转录组分析。肠道微生物组16S rRNA数据集（SRA: PRJNA897842和PRJNA833670）作为独立队列分析，RL95-2 qRT-PCR实验被解释为概念验证。
结果：在EC免疫微环境中鉴定出10个主要细胞群体。在该单个应答者/非应答者样本对中，非应答者样本显示出与更高M2相关巨噬细胞标志物表达、升高T细胞检查点/耗竭标志物表达以及较低细胞毒活性评分一致的模式。这些观察为描述性，不能确立患者水平显著性。TCGA-UCEC分析以及独立微生物组和RL95-2实验提供补充性、假设生成性证据；未报告未经验证的分类器性能估计。
结论：本研究提供了一个EC应答者和一个非应答者样本中免疫模式的假设生成性描述，辅以TCGA-UCEC、独立微生物组数据集和RL95-2概念验证实验。研究结果提名候选免疫、激素和微生物组相关通路以供进一步研究，但未确立患者水平反应差异、因果关系或临床验证的生物标志物。

论文主体部分解读

子宫内膜癌（EC）是常见妇科恶性肿瘤，具有显著分子和临床异质性。肿瘤免疫微环境影响疾病进展，并可能塑造免疫治疗反应，但区分治疗反应状态的细胞程序仍未完全明确。子宫内膜免疫微环境是特化组织生态位，在月经周期和疾病中发生广泛重塑；子宫自然杀伤细胞（uNK）、巨噬细胞、T细胞亚群和基质细胞协调组织重塑、炎症控制及母胎界面耐受，而这些谱系及信号程序在恶性子宫内膜组织中可能改变。巨噬细胞在促炎与抗炎状态间呈功能可塑性；T细胞亚群包括CD4⁺辅助性、CD8⁺细胞毒性和调节性T细胞，塑造局部免疫耐受与抗肿瘤活性；树突状细胞连接固有与适应性免疫。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可高分辨率表征复杂组织微环境。LIF（leukemia inhibitory factor）及其受体LIFR构成参与子宫内膜基质和免疫调节的细胞因子轴，但其与EC反应生物学的关系尚待未来直接重复研究。新兴证据提示肠道微生物组可调节系统性炎症张力和免疫稳态，失调、短链脂肪酸产生改变及脂多糖（LPS）等微生物产物可能影响固有免疫信号。为此，研究人员开展以EC免疫微环境为中心的假设生成性多组学分析，整合来自接受抗–PD-1免疫治疗的两个EC样本的scRNA-seq（GSE251923；一个应答者GSM7990051和一个非应答者GSM7990052；17,546个细胞）、TCGA-UCEC bulk转录组和独立肠道微生物组数据集（PRJNA897842和PRJNA833670）。由于微生物组与scRNA-seq队列不重叠，微生物组发现被独立解释，不作为患者内机制证据。RL95-2 qRT-PCR实验提供独立的概念验证性刺激响应基因表达评估。研究得出结论：该单细胞样本对中的M2相关巨噬细胞标志物、T细胞检查点/耗竭标志物和细胞毒活性模式为描述性；TCGA-UCEC、微生物组和RL95-2证据为补充性、假设生成性；未确立患者水平反应差异、因果关系或临床验证生物标志物。其意义在于提名候选免疫、激素和微生物组相关通路供进一步研究。

关键技术方法：单细胞数据来自GEO GSE251923，含两个接受抗–PD-1治疗的EC样本：GSM7990051为应答者，GSM7990052为非应答者，每组一个生物样本；质控后保留17,546个细胞。使用Scanpy、Leiden聚类、UMAP和PCA；差异表达采用Wilcoxon秩和检验，阈值|log₂FC|>0.25、Benjamini–Hochberg校正p<0.05；通路富集采用gseapy Enrichr过表征分析（ORA），基因集为GO biological process、KEGG和MSigDB Hallmark。TCGA-UCEC bulk RNA-seq含554个肿瘤和35个正常样本。肠道微生物组16S rRNA数据来自独立SRA队列PRJNA897842和PRJNA833670。RL95-2 qRT-PCR作为概念验证；生存分析采用Kaplan–Meier法，TCGA-UCEC计算ESTIMATE免疫和基质评分。

3.1 子宫内膜癌免疫微环境的单细胞转录组景观：通过质控后17,546个细胞UMAP嵌入识别10个群体，包括B细胞（5.1%）、成纤维细胞（16.7%）、上皮细胞（14.7%）、T细胞（10.7%）、巨噬细胞（3.9%）和其他谱系；细胞类型组成在应答者与非应答者间呈描述性差异，谱系定义标志物确认聚类分配；因每组仅一个生物样本，不解释为患者水平统计显著效应。
3.2 免疫细胞亚型特征与转录异质性：亚聚类解析免疫谱系内转录异质性，提示激活、耗竭和效应程序差异；在单个非应答者样本中，选定T细胞亚群检查点/耗竭标志物（PDCD1、CTLA4、LAG3、TIGIT、HAVCR2）较高，细胞毒活性评分较低，巨噬细胞M2相关标志物（CD163、MRC1、MSR1）表达高于单个应答者样本；这些模式为描述性、假设生成性，细胞水平检验在无生物重复时不能提供患者水平推断。
3.3 EC免疫细胞中的差异表达与通路富集：探索性细胞水平分析优先筛选出6975个符合预设Wilcoxon/校正p阈值基因（非应答者细胞集中6433个较高、542个较低），巨噬细胞贡献最多优先基因；由于每个条件一个供体，该计数可能高估推断精度，不应解释为6975个独立验证的条件相关差异表达基因（DEG），仅用于假设生成。
3.4 TCGA-UCEC中的bulk转录组分析与临床意义：TCGA-UCEC bulk RNA-seq比较554个肿瘤与35个正常样本，鉴定6511个上调和6502个下调DEG，PRAME（log₂FC=4.9，p=2.1×10^?15）和DES（log₂FC=?6.9，p=1.1×10^?22）为最高差异表达基因；PCA、差异表达、免疫组成、免疫检查点、生存、临床因素、跨平台倍数变化、通路活性和免疫特征分析均为探索性分析。
3.5 EC中肠道微生物群改变与诊断意义：EC患者α多样性似乎降低，Shannon和Chao1差异p=0.004和p=0.008；PCoA显示样本水平组成模式，保留的PERMANOVA不显著（p=0.593）；门水平Bacillota和Bacteroidota为两组优势成分；属水平丰度、差异分类单元和微生物相关网络提示Bilophila、Roseburia和Faecalicatena等属差异；微生物组样本来自独立于GSE251923的队列，因此不能与scRNA-seq免疫表型在个体患者水平关联。
3.6 探索性微生物组相关诊断建模：通过微生物α多样性与可用临床特征探索性关联，以及微生物组随机森林分类器和特征重要性分析；随机森林模型AUC=0.865；因微生物组数据独立于GSE251923，该分析不代表患者内宿主-微生物组模型，应解释为探索性。
3.7 RL95-2细胞中的qRT-PCR概念验证分析：在RL95-2（ATCC HTB-109）细胞三种刺激条件下进行qRT-PCR；TGF-β1刺激下KLRB1（7.0±0.74倍降低，p<0.001）、CD56（7.75±0.71倍降低，p<0.001）和EOMES（8.67±0.85倍降低，p<0.001）受抑制，FOXP3升高2.73±0.42倍（p<0.001）；LPS刺激下CD68上调2.46±0.38倍（p<0.001）；雌激素剥夺（charcoal-stripped serum）下ESR1下调11.3±1.38倍（p<0.001），与雌激素剥夺上皮背景一致；结果以相对溶剂对照的倍数变化表示（mean±SEM，n=3独立实验），表明RL95-2细胞中刺激响应性表达，但不验证scRNA-seq观察到的免疫细胞特异性反应。

讨论总结：讨论指出，本研究提供以EC免疫微环境为中心的假设生成性多组学分析。scRNA-seq部分仅分析两个患者（一个应答者、一个非应答者）的17,546个细胞，而TCGA-UCEC和微生物组数据集来自独立队列，提供补充信息。表观M2相关巨噬细胞模式和T细胞耗竭模式是该样本对中的描述性观察，而非患者水平推断发现。微生物组和RL95-2结果被解释为独立、互补证据流。非应答者样本中巨噬细胞M2相关标志物如CD163、MRC1、MSR1表达更高，选定T细胞亚群检查点标志物表达更高且细胞毒活性评分更低；这些观察产生协调性髓系和T细胞免疫抑制的生物学合理假设，但缺乏生物重复，无法区分治疗反应生物学与个体间变异、技术采样效应或批次效应。细胞水平Wilcoxon检验优先的6975个基因应视为探索性候选，而非确认性DEG。RL95-2实验提供概念验证证据，表明选定转录本在子宫内膜癌上皮背景下对TGF-β1、LPS或雌激素剥夺有响应，但不能验证uNK细胞中NK谱系程序抑制、巨噬细胞极化或Treg生物学，因为RL95-2不是免疫细胞，且刺激分别应用而非联合微环境模型。微生物组发现需谨慎解释：多样性降低及Bilophila、Roseburia和Faecalicatena相关变化与微生物失调、内毒素暴露和炎症信号假设相容，但微生物组和scRNA-seq数据来自非重叠队列，因此无法证明肠道失调驱动或机制性放大GSE251923中免疫模式；提出的微生物组-TLR4-NF-κB-免疫轴是可检验模型，需在配对纵向队列和实验干预研究中验证。局限性包括scRNA-seq仅两个生物样本、细胞水平Wilcoxon检验将同一供体细胞视为独立观察可低估生物方差、优先基因数可能部分反映伪重复、缺乏生物重复时无法进行供体水平pseudobulk分析；微生物组与scRNA-seq非重叠，不能建立患者内宿主-微生物组整合和因果联系；16S rRNA测序分类学与功能分辨率有限；RL95-2为上皮癌细胞系，不能验证uNK、巨噬细胞或T细胞特异性转录反应，分离刺激条件也不重现整合多细胞微环境；可用记录不支持重建额外未报告模型参数或不确定性估计，所有保留建模结果均为探索性。

结论翻译：总之，本研究基于一个应答者和一个非应答者scRNA-seq样本，并辅以TCGA-UCEC分析、独立微生物组数据集和RL95-2概念验证实验，提供了EC免疫微环境的描述性、假设生成性观点。数据提名候选巨噬细胞、T细胞、激素和微生物组相关通路供未来研究，但未确立患者水平反应差异、因果宿主-微生物组机制或临床验证生物标志物。需要更大规模、生物重复的EC队列、配对宿主-微生物组数据集、原代免疫细胞实验和独立指定模型验证研究来检验这些假设。