由 Pseudomonas chlororaphis subspecies aureofaciens 驱动的钴微生物腐蚀受控制 Co(0) 溶解度的非生物与生物过程复杂互作调控

《Environmental Microbiology》：Microbially-Induced Corrosion of Cobalt by Pseudomonas chlororaphis subspecies aureofaciens Is Driven by the Complex Interplay Between Abiotic and Biotic Processes That Control Cobalt Solubility

　　

由氧化还原活性代谢物驱动的微生物诱导腐蚀（microbially-induced corrosion, MIC）已在含铁基础设施中得到充分研究，但此类途径是否溶解经济上至关重要的钴仍知之甚少。本研究使用模式细菌 Pseudomonas chlororaphis subspecies aureofaciens，以检验氧化还原活性吩嗪（phenazines）是否腐蚀元素钴。在与 Co(0) 丝孵育一周后，不能产生吩嗪的突变体腐蚀的钴量与野生型（wild-type）细胞一样多，而单独吩嗪并未诱导腐蚀。使用无细胞耗尽培养基（cell-free spent medium）的缺氧（anoxic）腐蚀测定表明，吩嗪可在缺乏氧等氧化剂的条件下维持 Co(0) 氧化，但氧和活细胞强烈促进腐蚀。通过构建 ?phz?hcn 突变体限制参与腐蚀的代谢途径，导致与野生型相比钴溶解量翻倍，这是由于可能影响候选金属载体（putative metallophores）生产的代谢重编程（metabolic rerouting）。地球化学和电化学分析表明，这些金属结合代谢物使钴保持在溶液中，并阻止抑制 MIC 的钝化层（passivation layer）形成。本研究表明，控制钴溶解度和生物可利用度（bioavailability）的非生物与生物途径之间的复杂相互作用支配 MIC。理解这些机制对于减轻与 MIC 损害基础设施相关的担忧，以及优化固体废物的可持续钴回收策略至关重要。

研究背景：微生物诱导腐蚀（microbially-induced corrosion, MIC，即微生物氧化金属并促使其溶解）由生物膜形成引起，估计每年造成数万亿美元金属基础设施损失。MIC 发生时，细菌或古菌将固体元素金属氧化为可溶离子，已有机制包括直接电子传递（direct electron transfer, DET）和介导电子传递（mediated electron transfer, MET）。目前 MIC 机理理解主要来自铁和不锈钢，其他经济、环境和生理相关金属的 MIC 机制仍研究不足。钴因耐用、耐高温和抗腐蚀而用于合金，广泛用于石油天然气关键基础设施，也用于人工关节、电池和电子废物；钴还是细菌必需微量元素。模式菌 Pseudomonas chlororaphis subspecies aureofaciens 产生羧化和羟基化吩嗪（phenazines，一类氧化还原活性次级代谢物），其主要吩嗪产物吩嗪-1-羧酸（PCA）可将 Co(0) 氧化为 Co(2+)，且该反应在热力学上有利。研究人员因此检验吩嗪是否能腐蚀元素钴，并比较野生型与缺失 phz 或 hcn 操纵子的突变体，以解析非生物与生物过程如何控制钴溶解度。该研究的重要意义在于理解 MIC 对关键金属迁移和毒性的影响，并为固体废物中钴的可持续回收提供依据。

关键技术方法概括：研究人员构建 ?phz、?hcn 和 ?phz?hcn 缺失突变体；以 Co(0) 丝进行 168 h 好氧、缺氧及硝酸盐补充腐蚀测定，并设置无细胞耗尽培养基（spent medium）和 PCA 标准处理；用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）测定 Co(2+) 并进行质量平衡；用剂量-反应和 EDTA 洗涤区分细胞吸附与胞内钴；用液相色谱-高分辨质谱（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry, LC-HRMS）进行靶向吩嗪定量和非靶向代谢组分析；用扫描电子显微镜-能量色散 X 射线光谱（scanning electron microscopy coupled to energy dispersive X-ray spectroscopy, SEM-EDX）、粉末 X 射线衍射（powder X-ray diffraction, PXRD）和 PHREEQC 地球化学建模分析表面产物；用开路电位（open circuit potential, OCP）和循环伏安法（cyclic voltammetry, CV）评估电化学过程；用长读长基因组测序、antiSMASH、DRAM 和自定义 DET 基因数据库分析基因组与生物合成基因簇。菌株为 P. chlororaphis subspecies aureofaciens ATCC 13985，最初分离自 Maas River 煤油污染黏土。

研究结果：2.1 Live Cells Can Corrode Cobalt in the Absence of Redox-Active Phenazines（活细胞可在无氧化还原活性吩嗪时腐蚀钴）：将野生型、?phz、?hcn、?phz?hcn 与 Co(0) 丝孵育 168 h 后，野生型 Co(2+) 达 2188.17 ± 730.91 μM，显著高于无菌培养基 240.47 ± 76.45 μM；热杀死对照为 275.89 ± 12.50 μM；无细胞耗尽培养基为 586.44 ± 147.91 μM。?phz 达 2139.84 ± 308.55 μM，与野生型无统计差异；?hcn 为 1362.93 ± 249.18 μM，也无显著差异；PCA 标准 50 μg/mL 与无菌对照无差异。?phz?hcn 最高，达 5144.30 ± 956.90 μM，线材质量损失为 51.44% ± 5.55%。结论是吩嗪并非腐蚀必需，活细胞和其他代谢物促进钴溶解，双缺失突变导致腐蚀意外增强。

2.2 Metabolic Rerouting Is Associated With Different Corrosion Rates（代谢重编程与不同腐蚀速率相关）：LC-HRMS 非靶向代谢组显示缺失突变体与野生型代谢组不同，PCA 缺失是主要差异。Kruskal–Wallis 检验显示数千个代谢特征差异，多数 m/z 为 400–1000。生物合成基因簇分析发现 Cluster 6 与 schizokinen/vibrioferrin 同源，Cluster 10/11 预测可产生 pyoverdines 等金属载体。靶向比较显示，双突变中 m/z 1095.22634 接近 Pf-5 pyoverdine，m/z 430–445 类似 schizokinen/vibrioferrin 的特征强度更高。结论是基因缺失导致代谢重编程，可能将碳氮重分配至候选金属载体，并与腐蚀差异相关。

2.3 Cobalt Toxicity Limits Cell Growth and Capacity for Corrosion（钴毒性限制细胞生长和腐蚀能力）：活细胞加丝时 168 h 活菌数从约 10¹⁰ CFU/mL 降至约 10⁶ CFU/mL，无丝对照正常。CoCl₂ 剂量-反应中半数抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC₅₀）为 14.79 ± 0.86 μM，低于腐蚀实验中 24 h 的约 700–1400 μM Co(2+)。EDTA 竞争配体显示大多数 Co(2+) 留在溶液，细胞关联占 3.62%–15.53%，胞内少于 11%，吸附为 1.53%–5.88%；200 μM 时胞内比例下降，2000 μM 时约 75% 细胞关联钴为胞内。结论是少量 Co(2+) 进入细胞即可致毒，吸附和摄取为次要钴汇，毒性限制 MIC 程度。

2.4 Redox-Active Metabolites Support Corrosion in the Absence of Critical Oxidants Like Oxygen（氧化还原活性代谢物在缺乏氧等关键氧化剂时支持腐蚀）：缺氧活细胞 Co(2+) 最低，为 10.09 ± 3.05 μM，质量损失 0.29% ± 0.27%；缺氧无菌也降低。硝酸盐不增加缺氧无菌腐蚀，但增加缺氧活细胞腐蚀，同时降低活细胞活力，且与好氧无菌无统计差异；硝酸盐还原未与 Co(0) 氧化耦合。基因组分析未发现支持 DET 的外膜细胞色素等。缺氧耗尽培养基中，野生型加或不加硝酸盐与好氧耗尽培养基无统计差异；?phz 缺氧耗尽培养基仅 82.45 ± 30.01 μM，比其好氧处理低一个数量级，并与缺氧无菌 83.59 ± 21.01 μM 不可区分。结论是氧是主要氧化剂，好氧活细胞最利于腐蚀；吩嗪可在无氧时维持 Co(0) 氧化，但非唯一途径。

2.5 Cobalt Phosphate Minerals Form a Passivation Layer That Inhibits Corrosion（钴磷酸盐矿物形成抑制腐蚀的钝化层）：SEM–EDX 显示无菌和 PCA 处理有线材均匀溶解与钝化区，活细胞形成长条凹槽；?phz?hcn 腐蚀最明显，直径相对无菌线材降低 28.31%–33.51%。EDX 暗区 Co:O 约 1:5、Co:P 约 1.5–2:1，亮区钴含量更高。PHREEQC 预测 CoHPO₄(aq) 主导，Co₃(PO₄)₂(s) 与少量 Co₃O₄(s) 可沉淀。PXRD 在好氧处理中检测到 Co₃(PO₄)₂·8H₂O 和 Co(0)，缺氧处理无钴磷酸盐反射。结论是 Co(0) 先氧化为 Co(2+)，随后水合钴磷酸盐沉淀形成钝化层并限制 MIC。

2.6 Complex Abiotic and Biotic Reactions That Affect Cobalt Solubility Control Corrosion（影响钴溶解度的复杂非生物和生物反应控制腐蚀）：OCP 变化小，PCA 与未加对照相似，耗尽培养基变化最大；OCP 单独不能反映钴溶解。CV 显示无菌培养基 0 h 有 Co(0) 氧化峰，24 h 后消失，说明钝化快；PCA 相似。野生型活细胞 0 和 24 h 类似无菌，72 h Co(0) 氧化电流指数增加并释放高浓度 Co(2+)；耗尽培养基 0 h 峰更明显但 24 h 后不维持。结论是活细胞促进破坏约 24 h 形成的钝化层，细胞或代谢物与 Co(2+) 相互作用使钴留于溶液并抑制沉淀。

讨论部分总结：该研究提供多条证据表明 P. chlororaphis subspecies aureofaciens 能腐蚀元素钴。初始假设认为吩嗪氧化是核心，但活细胞和耗尽培养基在无吩嗪时仍可腐蚀，PCA 单独不腐蚀；氧是关键氧化剂。缺氧野生型耗尽培养基仍可腐蚀，仅 ?phz 缺氧耗尽培养基受抑制，因此不能完全排除吩嗪作为氧化剂，但研究人员认为其可能是次要贡献者。代谢重编程可能增加候选金属载体合成，如 pyoverdines、schizokinen、vibrioferrin 类似物。Co(2+) 吸附和摄取为次要汇，毒性限制 72 h 后腐蚀。地球化学、PXRD 和 SEM–EDX 表明 Co(2+) 可沉淀为水合钴磷酸盐，类似铁磷酸矿物减缓铁腐蚀；CV 显示钝化层动态变化，活细胞可破坏初始层，随后稳定结晶磷酸层随毒性形成并限制 MIC。活细胞可回收结合 Co(2+) 的代谢物，螯合钴以对抗钝化，解释其腐蚀高于耗尽培养基。DET、氢中间体或 H⁺/有机酸脱质子途径证据不足。该机制与真菌草酸盐促进 Cu(0) 腐蚀类似，但与部分 P. aeruginosa phz 基因腐蚀研究不同，后者多涉及保护性氧化铬层、生物膜生长或群体感应；X80 碳钢中单独吩嗪不腐蚀与本研究一致。浮游培养和搅拌增加氧扩散，可能影响结果。

研究结论翻译：研究人员得出结论，P. chlororaphis subspecies aureofaciens 对元素钴的腐蚀并非仅依赖吩嗪。相反，氧对将 Co(0) 氧化为可溶性 Co(2+) 至关重要，Co(2+) 与细胞相互作用诱导毒性或形成含磷酸盐沉淀抑制腐蚀。活细胞存在导致最佳腐蚀，可能通过持续产生或回收未鉴定金属载体使 Co(2+) 不沉淀。本研究强调氧化还原活性代谢物生物合成途径与控制金属生物可利用度代谢物之间的联系。未来研究人员将结合转录组学和代谢组学靶向 P. chlororaphis subspecies aureofaciens 生物合成基因，确认负责钴溶解的金属-配体复合物。识别这些途径对扩展 MIC 影响不同环境中关键金属命运的理解、优化基于 MIC 的金属回收策略至关重要。Pseudomonas 属成员适合此类研究，因为它们广泛分布于原始和人为影响栖息地，可在复杂生物膜群落中产生多种氧化还原活性和金属结合代谢物，且已有许多遗传可操作模型。此类机制研究对关键工业部门开发 MIC 缓解策略，以及从电子废物等 mg/kg 浓度废物流中可持续回收金属至关重要。本研究提供见解可用于缓解钴和含铁基础设施的 MIC，因两种金属共存于耐磨和耐腐蚀材料中。细胞与 Co(2+) 相互作用促进钴溶解，也为针对电池和电子废物中钴氧化物（如 Co₃O₄）的生物回收策略提供可能。基于 MIC 的方法依赖中温和近中性条件下天然代谢物，可规避当前火法冶金和湿法冶金提取的环境足迹，并可能替代嗜酸细菌。使用浮游细菌的 MIC 机制可适配现有生物浸出基础设施。尽管 MIC 损害基础设施仍是优先问题，本研究主张将叙事转向 MIC 如何支持可持续金属回收，从钴开始。