常见商业农药制剂对肝（HepG2）与肾（HEK-293）细胞系的细胞毒性与氧化效应：人类健康与环境安全启示

《JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY》：Cytotoxic and Oxidative Effects of Common Pesticides on Hepatic and Renal Cell Lines (HepG2 and Hek-293): Implications for Human Health and Environmental Safety

　　

现代农业实践使人类和环境暴露于众多化学农药。越来越多证据表明，商业农药制剂可能含有助剂和添加剂，从而表现出与其活性成分单独作用不同的毒理学特性。本研究评估了突尼斯常用商业农药制剂对人肝（HepG2）和肾（HEK-293）细胞系的细胞毒性和氧化效应。受试制剂含溴氰菊酯（deltamethrin）、氯菊酯（permethrin）、阿维菌素（abamectin）、吡虫啉（imidacloprid）、代森锰锌（mancozeb）、硫磺（sulfur）、α-氯醛糖（alpha-chloralose）、2,4-D-2-乙基己酯（2,4-D-2-ethylhexyl ester）、双氟磺草胺（florasulam）、解草酯（cloquintocet-mexyl）、炔草酯（clodinafop-propargyl）和唑啉草酯（pinoxaden）。细胞活力采用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，MTT）法评估，膜损伤采用乳酸脱氢酶（LDH）法评估。测定了每种制剂的半数最大抑制浓度（IC₅₀）值。代森锰锌在两种细胞系中表现出最高细胞毒性，而硫磺和α-氯醛糖毒性最低。细胞内活性氧（ROS）测量显示，暴露于若干制剂后出现显著氧化应激，并与细胞活力降低和LDH释放增加相关。显微镜检查进一步显示暴露细胞出现与凋亡和坏死一致的核改变。这些发现强调，在评估潜在细胞毒性和氧化效应时，应评估完整商业农药制剂，而非仅活性成分。结果支持将基于制剂的测试纳入毒理学风险评估，以更好表征与农药暴露相关的潜在人类健康危害。

研究背景方面，现代农业广泛使用农药控制昆虫、杂草、真菌和其他农业有害生物，但人类暴露仍是重要毒理学问题。商业农药产品不仅含活性成分，还含助剂、表面活性剂、溶剂和其他添加剂，这些成分可能改变其生物学效应。既往比较研究提示，一些商业制剂的毒理学效应可能不同于单个活性成分，甚至更强。当前监管和毒理评估常聚焦单一活性成分，但商业产品的生物活性也可能取决于不同组分间相互作用。肝和肾参与外源物的代谢、生物转化和清除，是重要靶器官。HepG2和HEK293已作为实用体外模型用于研究化学物诱导的细胞毒性和靶器官反应，但完整商业农药制剂在互补肝、肾人细胞模型中的细胞毒性和氧化效应关注较少。对于突尼斯当地农业使用的商业制剂，仅凭主要活性成分性质不能必然预测其毒性。因此，研究人员评估突尼斯常用商业农药制剂在肝HepG2和肾HEK293细胞中的细胞毒性、膜损伤、氧化应激和核形态改变，以补充完整制剂的毒理证据。

研究人员开展的研究纳入代表杀虫剂、杀菌剂、除草剂和杀鼠剂的商业制剂，包括单活性成分及多组分制剂。HepG2和HEK293作为互补体外模型，分别研究肝和肾细胞反应，不用于两种细胞系间直接生物比较。结果显示，代森锰锌在HEK-293中IC₅₀最低，阿维菌素在HepG2中IC₅₀最低；阿维菌素和溴氰菊酯在两种细胞中均有明显毒性；硫磺和α-氯醛糖毒性较低；若干制剂引起ROS升高、细胞活力下降、LDH释放增加和凋亡/坏死样核改变。其意义在于支持将完整商业制剂测试纳入毒理学风险评估，以更好表征农药暴露相关潜在健康危害。

为开展研究，研究人员选择突尼斯常用商业农药制剂，涵盖杀虫剂、杀菌剂、除草剂和杀鼠剂，并包含单活性成分制剂和多组分制剂。使用人肝HepG2和人胚肾HEK293细胞系，二者均来自突尼斯Sfax生物技术中心（CBS）。关键技术方法包括：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，MTT）法检测细胞活力并计算IC₅₀（半数最大抑制浓度）；乳酸脱氢酶（LDH）释放试验检测膜损伤；DCFDA/H₂DCFDA（2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯/2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯）试剂盒检测细胞内ROS（活性氧）；DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色观察核形态。统计分析使用GraphPad Prism 9，采用非线性回归、Shapiro–Wilk检验、Brown–Forsythe检验、单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。无人类参与者或动物直接参与。

研究结果方面，3.1 农药细胞毒性（MTT和LDH试验）：通过MTT法，研究人员发现IC₅₀随农药和细胞系而异。在HEK-293中，代森锰锌IC₅₀最低（11.76±2.30 μM），其次为阿维菌素（29.90±1.23 μM）和溴氰菊酯（32.10±1.23 μM）。在HepG2中，阿维菌素IC₅₀最低（20.72±0.87 μM），其次为代森锰锌（23.25±1.24 μM）和溴氰菊酯（29.09±0.87 μM）；硫磺IC₅₀最高（98.37±6.74 μM），细胞毒性较低。LDH释放试验与MTT结果一致，阿维菌素和溴氰菊酯使LDH释放较对照增加约40%–50%（p < 0.05），2,4-D-2-乙基己酯使LDH泄漏增加约30%，尤其在HEK-293中；硫磺和α-氯醛糖未引起显著LDH变化。结论是农药在IC₅₀浓度下通过代谢抑制和膜完整性丧失损害细胞活力。

3.2 氧化应激评价（ROS试验）：通过DCFDA/H₂DCFDA检测，细胞内ROS水平随制剂不同而变化。仅部分处理较对照组有统计学显著升高。HepG2中若干制剂仅轻度增加且未达显著，而HEK-293中反应更明显。吡虫啉和代森锰锌处理可见中等ROS升高，硫磺和α-氯醛糖未引发明显氧化反应。结论是若干农药可诱导细胞内ROS积累，且与细胞毒性指标相伴随。

3.3 核损伤与凋亡的显微镜观察：通过DAPI染色观察，对照细胞核大、圆至椭圆且荧光均匀。阿维菌素处理细胞显示核浓缩、核形状不规则和多个强染色核碎片；溴氰菊酯处理显示广泛核碎裂；2,4-D-2-乙基己酯导致核轮廓不规则和部分碎裂，提示凋亡和坏死混合模式。代森锰锌和吡虫啉仅引起轻度核改变；硫磺、α-氯醛糖、氯菊酯、Nicos和Traxos 45 EC等对核形态影响最小。结论是特定农药尤其阿维菌素、溴氰菊酯和2,4-D-2-乙基己酯可触发凋亡相关核损伤。

讨论总结：研究人员认为，阿维菌素和溴氰菊酯产生最低IC₅₀，与既往报告其诱导哺乳动物细胞氧化应激和凋亡一致；既往如Castanha Zanoli et al.、Wu et al.等提示阿维菌素可影响线粒体生物能量学，但本研究未直接评估这些机制。溴氰菊酯作为II型拟除虫菊酯，既往被报道可通过电压门控钠通道和钙水平改变引起氧化应激和线粒体功能障碍。LDH升高支持膜损伤，膜失稳是氧化应激和脂质过氧化的常见后果。ROS显著增加，尤其溴氰菊酯、阿维菌素和2,4-D-2-乙基己酯，与细胞活力下降和LDH释放增加呈正相关，提示氧化失衡参与毒性。HEK-293较HepG2对某些农药更敏感，可能与代谢能力和抗氧化防御差异有关。DAPI结果支持ROS介导的程序性细胞死亡通路。硫磺和α-氯醛糖毒性较低。研究支持商业制剂可能比单个活性成分活性更强，但由于未平行测试纯活性成分，不能判定助剂贡献。局限包括仅两种体外细胞系、仅48 h急性暴露、未进行配方特异性无细胞对照，机制通路仍需进一步研究。

研究结论翻译：本研究强调突尼斯常用农药对肝（HepG2）和肾（Hek-293）细胞系具有显著细胞毒性和氧化效应。研究结果强调评估完整商业农药制剂的重要性。然而，由于未并行测试纯化活性成分，本研究无法确定表面活性剂、助剂或其他制剂成分对所观察毒性的贡献。阿维菌素和溴氰菊酯被确定为细胞毒性最强，而硫磺和α-氯醛糖在IC₅₀浓度下影响最小。尽管在处理细胞中观察到ROS水平升高并伴随凋亡和坏死，但该关系仍为相关性。需进一步机制研究以确定氧化应激是否直接驱动细胞死亡通路。这些发现表明，在受试实验条件下，若干商业农药制剂可在人肝和肾细胞模型中诱导细胞毒性、氧化应激、膜损伤和核形态改变。结果进一步强调，评估完整商业制剂而非仅依赖单一活性成分数据，对于改善农药暴露相关潜在毒理学危害表征具有重要意义。有必要使用互补实验模型和机制方法开展更多研究，以进一步阐明所涉生物学通路。