可可中苦味2,5-二酮哌嗪类化合物激活人类苦味受体TAS2R14与TAS2R43的研究

《Molecular Nutrition & Food Research》：Bitter 2,5-Diketopiperazines From Cocoa Activate Human Bitter Taste Receptors

　　

中文摘要翻译 人类味觉系统能够快速分析食物中的营养与非营养成分。尽管苦味被视为摄入潜在有害物质的预警信号，但并非所有苦味物质都有毒，适度的苦味通常能被容忍甚至受到偏好。负责检测食物中苦味物质的是位于口腔内的约25种人类苦味受体（TAS2Rs）。在热加工食品中发现的一类重要苦味化合物是2,5-二酮哌嗪类化合物（2,5-diketopiperazines），即由两个L-氨基酸组成的环状二肽，它们通常是多肽降解产物。虽然2,5-二酮哌嗪类化合物已被确定为许多食品苦味的主要贡献者，但尚不清楚哪种人类苦味受体介导了它们的检测。利用功能性钙动员实验（calcium-mobilization assays），研究人员鉴定出两种对人类2,5-二酮哌嗪类化合物有反应的人类苦味受体：TAS2R14和TAS2R43。在两种激活TAS2R43的2,5-二酮哌嗪类化合物中，顺式-环(L-亮氨酸-L-苯丙氨酸)（cis-cyclo(L-Leu-L-Phe)）表现出最高的效力，其阈浓度（threshold concentration）为100 μM。对2,5-二酮哌嗪类化合物相关的线性二肽进行的进一步测试表明，2,5-二酮哌嗪类化合物代表了一类独立的苦味化合物，因为未发现其与相应二肽的激活模式存在重叠。

论文解读文章

研究背景与目的

巧克力是全球最主要的商品之一，其关键成分可可豆以其丰富的感官特性闻名，包括甜、苦、酸、涩和芳香。特别是黑巧克力，其标志性的均衡苦味源于多种化合物，这些化合物被认为是可可植物抵御病原体、昆虫和草食动物的保护剂。已有研究确定，可可苦味的主要贡献者是生物碱（如咖啡因和可可碱）以及在烘焙过程中形成的2,5-二酮哌嗪类化合物（2,5-diketopiperazines，由两个L-氨基酸构成的环状二肽）。

苦味感知是通过口腔内的苦味受体（TAS2Rs）介导的。人类约有25种功能性TAS2Rs，它们在检测苦味物质方面差异显著：有的受体宽泛地响应多种化合物，有的则只对少数激动剂敏感。此前，可可中的关键苦味物质，如咖啡因、可可碱和多酚类化合物，其对TAS2Rs的激活谱已有报道。例如，咖啡因可激活五种TAS2Rs（TAS2R7、-R10、-R14、-R43和-R46），可可碱仅激活TAS2R14，而(-)-表儿茶素则可激活TAS2R4、-R5和-R39。然而，尽管2,5-二酮哌嗪类化合物被确认为强烈的苦味物质，但它们所激活的具体受体谱此前从未被研究过。因此，本研究旨在阐明2,5-二酮哌嗪类化合物如何通过激活人类苦味受体来贡献于食物的苦味，并探讨其与线性二肽在苦味感知上的区别。

主要技术方法

研究人员采用了功能性钙动员实验（functional calcium-mobilization assays）来筛选2,5-二酮哌嗪类化合物对人类苦味受体的激活作用。实验中使用了稳定表达嵌合G蛋白Gα16gust44的HEK 293T细胞系，将编码26种人类TAS2Rs的表达质粒瞬时转染至这些细胞中。随后，向细胞施加不同浓度的2,5-二酮哌嗪类化合物及其相关的线性二肽，通过荧光成像读板仪（FLIPR^TETRA）监测细胞内钙离子浓度变化，以此评估受体激活情况。数据分析采用非线性回归计算EC₅₀值，并将首次引起受体表达细胞与对照细胞间统计学显著差异的最低浓度定义为阈浓度（threshold concentration）。

研究结果

3.1 2,5-二酮哌嗪类化合物的受体筛选

研究人员从烤可可碎粒中选取了六种已知的2,5-二酮哌嗪类化合物进行筛选。结果显示，大多数TAS2Rs和大多数化合物均未导致特异性激活，但有两种受体和两种物质产生了特异性的荧光信号。具体而言，TAS2R43被顺式-环(L-亮氨酸-L-苯丙氨酸)（cis-cyclo(L-Leu-L-Phe)）选择性激活，而TAS2R14则同时对顺式-环(L-亮氨酸-L-苯丙氨酸)和顺式-环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)（cis-cyclo(L-Leu-L-Pro)）产生反应。

3.2 剂量-反应关系

通过递增激动剂浓度的实验，研究人员确定了活性化合物的剂量-反应关系。对于顺式-环(L-亮氨酸-L-苯丙氨酸)，其在TAS2R43上的EC₅₀值为0.041 ± 0.013 mM，表现出较高的效力和效能；而在TAS2R14上由于信号未饱和，无法计算EC₅₀值。相比之下，顺式-环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)仅激活TAS2R14，其EC₅₀值为0.269 ± 0.074 mM，但效能较低。在阈浓度方面，顺式-环(L-亮氨酸-L-苯丙氨酸)对TAS2R43和TAS2R14均为0.1 mM，而顺式-环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)对TAS2R14的阈浓度为0.3 mM。

3.3 线性二肽的比较分析

为探究2,5-二酮哌嗪类化合物的苦味是否与其环状结构有关，研究人员还测试了八种相应的线性二肽。结果显示，仅有三种线性二肽在高浓度下激活了单个受体：甘氨酰-L-脯氨酸（Gly-L-Pro）和L-亮氨酰-L-脯氨酸（L-Leu-L-Pro）激活了TAS2R43；L-亮氨酰-L-苯丙氨酸（L-Leu-L-Phe）则激活了TAS2R2。值得注意的是，这些激活模式与2,5-二酮哌嗪类化合物的激活模式并无重叠。因此，研究表明2,5-二酮哌嗪类化合物代表了一类独特的苦味物质，而非简单的另一种形式的二肽。

讨论与结论

本研究发现，在六种来自烤可可碎粒的2,5-二酮哌嗪类化合物中，只有两种能够在体外激活人类苦味受体。其中，顺式-环(L-亮氨酸-L-苯丙氨酸)的阈浓度为100 μM，这与先前感官研究中测得的190 μM苦味阈值基本吻合，且其激活的TAS2R43表现出最高的灵敏度。另一种活性化合物顺式-环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)的体外阈浓度为300 μM，而感官阈值为1190 μM，二者趋势一致但数值略有偏差。其他几种2,5-二酮哌嗪类化合物（如顺式-环(L-丙氨酸-L-丙氨酸)和顺式-环(甘氨酰-L-脯氨酸)）因感官苦味阈值较高或超出测试浓度范围，在体外实验中未观察到受体激活，这也与感官数据相符。

研究人员指出，尽管某些2,5-二酮哌嗪类化合物在可可碎粒中的剂量超阈值因子（DoT factors）可能小于1，表明其单独对整体苦味的直接贡献有限，但在复杂食品体系中，亚阈值浓度的多种化合物可能通过靶向同一受体产生叠加效应，从而共同达到激活浓度。此外，2,5-二酮哌嗪类化合物广泛存在于多种热加工食品中，如烘焙麦芽（啤酒）、咖啡、鸡汤、陈年清酒、孔泰奶酪以及面包（尤其是面包皮中含量极高），这表明它们在不同饮食中的苦味感知中扮演着重要角色。

研究结论：通过比较2,5-二酮哌嗪类化合物与其相关线性二肽的实验结果，研究人员得出结论，2,5-二酮哌嗪类化合物代表了一类独特的苦味物质，而非另一种形式的二肽，因为在任何TAS2Rs上均未观察到环状与线性肽的激活模式重叠。2,5-二酮哌嗪类化合物保守的中心结构、其可变性以及在众多食品中的广泛存在，预示着在TAS2Rs水平上可能存在显著的竞争效应，这将是未来研究的重要方向。