基于LC-MS/MS非靶向代谢组学与AIDDISON?平台的Pleurotus citrinopileatus抗糖尿病多靶点候选代谢物优先筛选

《Medicine in Drug Discovery》：From mushroom metabolome to prioritized anti-diabetic metabolite candidates: LC-MS/MS and AIDDISON?-assisted screening of Pleurotus citrinopileatus

　　

药物研发生产力的下降要求采用创新策略探索自然界庞大的化学多样性。传统天然产物发现受限于缓慢、资源密集型方法，而新型治疗药物可能存在于其中。本研究引入一种高通量工作流，将非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）与人工智能（AI）药物发现平台整合，以从蘑菇Pleurotus citrinopileatus中快速识别抗糖尿病候选物。高分辨液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定出1025个不同分子特征，并利用亚ppm质量精度和MS²碎片验证以高置信度注释。这些代谢物接受计算机ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）分析和药代动力学聚类，优先筛选出27个具有良好药代动力学特征的化合物（簇14，Cluster 14），包括预测的主动转运通透性。随后对该簇进行多靶点分子对接，靶向α-淀粉酶（α-amylase）、α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）和二肽基肽酶-4（DPP4），优先确定5S-hydroxynorvaline-S-Ile为高置信度多靶点命中化合物。该二肽样化合物对三种酶均表现出良好多靶点结合谱（dG = ?6.43、?6.26和?4.75 kcal/mol，分别对应DPP4、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶），通过与各自催化残基形成关键氢键实现。通过AutoDock进行的对接模拟进一步验证，5S-hydroxynorvaline-S-Ile是27个化合物中对三个靶点排名最高的结合剂。这项工作成功展示了一种新型AI驱动范式，可高效导航复杂代谢组学数据，以发现并优先筛选需实验验证的推定多靶点命中化合物，表明该整合方法可作为未来天然产物药物发现的高效优先筛选框架。

天然产物长期是药理学基石，为大量临床批准药物提供化学骨架，但近几十年来药物研发生产力下降。传统“grind and find”方法依赖反复生物测定指导分级分离，速度慢、资源密集，且易重发现已知化合物；产业转向合成分子库，却忽视天然产物结构复杂性和独特药理学。非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）和高分辨LC-MS/MS可从单个复杂样本检测大量分子特征，但产生数据洪流，注释瓶颈导致“暗代谢组”，仅少部分质谱可被高置信注释。人工智能（AI）和AIDDISON?等平台可进行高通量虚拟筛选、ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）预测和蛋白-配体相互作用建模。Pleurotus citrinopileatus为食用和传统药用真菌，含多糖、蛋白、酚类、黄酮和萜类；其提取物可抑制α-淀粉酶（α-amylase）和α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase），部分倍半萜可抑制PTP1B，糖尿病大鼠模型显示降血糖和升血清胰岛素，但具体抗糖尿病分子未知。因此，研究人员提出整合高分辨非靶向LC-MS/MS与AIDDISON? AI平台的工作流，对全部代谢组数据进行多靶点虚拟筛选、预测ADMET和分子对接，以快速优先筛选抗糖尿病候选。该论文发表在《Medicine in Drug Discovery》。

关键方法概括：研究材料为2024年4月在泰国受控栽培采集的Pleurotus citrinopileatus，采集坐标（14.01764, 100.53213）。关键方法包括：ITS（内部转录间隔区）DNA条形码鉴定物种；水/乙醇提取、3 kDa超滤和固相萃取（SPE）制备代谢物；UHPLC-Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS正负离子非靶向代谢组学；Compound Discoverer 3.1处理，mzCloud、ChemSpider、The Natural Products Atlas 3.0注释，FISh（Fragment Ion Search）验证；体外α-amylase、α-glucosidase、DPP4抑制实验；AIDDISON?进行ADMET药代动力学聚类（GMM、UMAP、PCA）；AIDDISON? Flare对接和AutoDock 4验证。

3.1 蘑菇材料与DNA条形码确认：琼脂糖凝胶电泳显示ITS扩增子约300 bp，阴性对照无条带；测序、BLAST和邻接法系统发育分析将样本聚类到Pleurotus citrinopileatus参考序列，确认物种鉴定。

3.2 LC-MS/MS代谢物鉴定：正负离子模式共检测1025个独特分子特征，质量误差为?0.24至0.04 ppm。数据库匹配和MS²碎片及FISh评分支持高置信注释。5S-hydroxynorvaline-S-Ile为第10丰富特征，峰面积7.8×10⁹；Hexitol的FISh覆盖度为93.51，2S-amino-butanoic acid为66.67，CI-4（diketopiperazine Pro-Arg）为62.5。

3.3 提取物对餐后血糖调节酶的抑制：提取物对α-amylase、α-glucosidase和DPP4均呈剂量依赖抑制。12.5 μg/mL时不显著，25、50和100 μg/mL时显著；最高抑制分别为41.3%、37.9%和37.1%。Acarbose对α-amylase和α-glucosidase抑制分别为80.4%和84.5%，Vildagliptin对DPP4为89.6%。粗提物为多组分体系，约40%最大抑制作为多药理学基线。

3.4 药代动力学聚类的代谢组学数据集：以六种药代动力学描述符进行GMM聚类，得到20个簇，并用UMAP和PCA可视化。PC1和PC2分别解释46.5%和35.7%方差，合计83.5%。簇14含27个化合物，HepG2细胞毒性预测为无活性，中等Caco-2通透性，CYP3A4/CYP2D6/CYP2C9抑制值一般低于0.02，分子量88.062–248.299 Da，logP为?2.04至?0.064，tPSA为54.37–94.83 ?²，hERG预测无活性，多参数优化（MPO）评分0.697，故被选为最有前景药物样代谢物。

3.5 分子对接与多靶点结合优先筛选：AIDDISON?对接显示5S-hydroxynorvaline-S-Ile结合最强且一致，dG分别为DPP4 ?6.43、α-amylase ?6.26、α-glucosidase ?4.75 kcal/mol；DPP4的VS Score为?9.5，配体效率（LE）平均?0.36。α-amylase中与Ile235、Glu233形成氢键，并与Tyr62疏水作用；DPP4中与Glu205、Tyr662形成相互作用，并与Phe357发生π–π堆积、与Val656疏水接触，类似Vildagliptin。其他化合物缺乏关键催化残基相互作用。

3.6 AutoDock对接确认：重新对接参考配体，α-glucosidase中葡萄糖RMSD为0.64 ?，DPP4中Vildagliptin为1.63 ?，α-amylase中Acarbose为3.52 ?，仅acarviosyl-glucose核心重算为1.72 ?。27个化合物对接中，5S-hydroxynorvaline-S-Ile（C₁₁H₂₀N₂O₃）结合能最佳：α-amylase ?5.01、α-glucosidase ?6.45、DPP4 ?5.43 kcal/mol，与AIDDISON?一致，并优于葡萄糖。结合位点和相互作用图显示其与参考配体共享特征，支持该平台用于小分子代谢物对接。

讨论部分总结：研究人员认为，高分辨质谱质量精度和正负电离提高覆盖度，MS²与FISh使注释从推测提升到高置信。已鉴定hexitol、L-pyroglutamic acid、L-isoleucine等与Pleurotus一致；CI-4（cyclo(Pro-Arg)）和Oximoaspergillimide值得注意，后者通常为Aspergillus化学分类标志，据原文所知此前未在Pleurotus等担子菌报道。AIDDISON?药代动力学聚类基于机器学习模型，Caco-2、HepG2和CYP模型具有验证指标，体现“fail-fast, fail-early”策略。5S-hydroxynorvaline-S-Ile结合能绝对值不大，是16重原子二肽样支架，因此应看LE：为?0.39（α-amylase）、?0.30（α-glucosidase）和?0.40（DPP4） kcal/mol每重原子，达到或超过|LE|≈0.30阈值；其不是确定治疗药，而是尺寸高效天然支架，需先导优化。该化合物在注释特征中峰面积排第10，约前十总和的3%、hexitol的13%；因无标准品不能转为质量分数，最高提取物剂量100 μg/mL下3%上限约3 μg/mL（约13 μM），可能不足以解释约40%抑制，更可能是簇14多个成分及其他提取物组分累加或协同。因此，5S-hydroxynorvaline-S-Ile是最高排名计算候选，而非已证明活性成分。局限包括：粗提物活性不代表单体；未分离、纯化、定量，纯化合物IC₅₀未获得；簇14为虚拟药代动力学簇，不是色谱或生物测定指导活性部位。未来需靶向分离、绝对定量、纯化合物IC₅₀、活性部位验证及细胞或体内确认。

研究结论翻译：本研究成功应对高效挖掘天然产物以发现新疗法的长期挑战。通过将高分辨代谢组学与先进AI驱动分析平台协同，研究人员建立了快速计算机优先筛选工作流，能够导航生物提取物巨大的化学复杂性，提名具有预测治疗相关性的推定代谢物。对Pleurotus citrinopileatus的研究从一千多种检测代谢物推进到一小组优先候选物，不是通过费力分级分离，而是通过智能、数据驱动的优先筛选。将5S-hydroxynorvaline-S-Ile优先为推定多靶点命中化合物，得到与三种临床相关抗糖尿病酶预测相互作用的支持。分子对接结果为可能生物活性提供了有机制基础的假说，揭示其与DPP4、α-amylase和α-glucosidase催化位点的特定相互作用。这种多药理学特征对于糖尿病等复杂代谢疾病尤其理想。虽然这些计算机发现是预测性的，但它们为下一阶段药物开发提供了坚实基础。直接路径包括靶向分离5S-hydroxynorvaline-S-Ile并随后体外验证其酶抑制。本研究作为明确的概念验证，将化合物从代谢组谱转化为优先多靶点候选物，准备进行临床前评估和未来优化。