靶向胆固醇代谢克服活化B细胞样弥漫大B细胞淋巴瘤对泽布替尼的耐药性

《Medicine in Novel Technology and Devices》：Targeting cholesterol metabolism to overcome Zanubrutinib resistance in activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma

　　

活化B细胞样弥漫大B细胞淋巴瘤（activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma，ABC-DLBCL）中，泽布替尼（Zanubrutinib）耐药细胞表现出胆固醇生物合成上调，其中HMGCS1、HMGCR和CYP51A1是耐药的关键介质。CD206阳性（CD206⁺）巨噬细胞介导的胆固醇外排可能通过促进肿瘤微环境中的胆固醇积累而促成泽布替尼耐药。阿托伐他汀（Atorvastatin）降低胆固醇水平，而泽布替尼抑制BTK活化并抵消HMGCS1、HMGCR和CYP51A1的代偿性上调，共同发挥强效的抗ABC-DLBCL协同活性。联合用药效能的增强与AID（激活诱导胞苷脱氨酶，AICDA）表达降低相关，AID是基因组不稳定性和耐药的关键调节因子。

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤最常见的亚型，其中活化B细胞样亚型（activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma，ABC-DLBCL）因B细胞受体（B-cell receptor，BCR）信号持续激活而侵袭性强、预后差。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）是BCR信号通路的关键激酶，BTK抑制剂已在ABC-DLBCL中显示出疗效。第一代BTK抑制剂伊布替尼存在耐药和脱靶毒性等限制；新一代BTK抑制剂泽布替尼虽具有改进的选择性，但临床已出现耐药报告，且其在DLBCL中的耐药机制仍远未明确。近期证据提示胆固醇代谢参与DLBCL发病和治疗耐药，但胆固醇代谢与泽布替尼耐药之间的潜在联系此前尚无探索。因此，研究人员开展了本研究，旨在解析泽布替尼耐药的代谢特征并寻找合理的联合治疗策略。

研究人员采用整合策略，对2例泽布替尼耐药和1例泽布替尼敏感的ABC-DLBCL患者淋巴结样本进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），并结合计算药物重定位分析与实验验证。通过体外耐药细胞系诱导、脂质染色、免疫印迹、异种移植瘤模型以及转录组分析，研究揭示了胆固醇代谢异常与泽布替尼耐药的密切关系，并鉴定阿托伐他汀为协同增敏药物。该研究首次将胆固醇合成通路与泽布替尼耐药机制联系起来，为通过代谢重编程克服B细胞淋巴瘤耐药提供了临床前依据。

主要关键技术与样本来源方面，研究人员使用了scRNA-seq及基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、伪时间分析、L1000平台药物筛选、耐药细胞系逐步诱导、组合指数（combination index，CI）评估、脂滴和游离胆固醇染色、免疫印迹、免疫组化、bulk RNA-seq及异种移植瘤模型。样本队列包括来自北京航空航天大学和北京高博博仁医院伦理委员会批准的3例ABC-DLBCL患者淋巴结活检标本（2例耐药、1例敏感），并纳入3例健康供者scRNA-seq数据（来自Roider等研究）作为对照。

研究结果分述如下：

3.1 过度活跃的胆固醇代谢与DLBCL发病相关。研究人员通过比较DLBCL患者与健康供者B细胞的scRNA-seq数据，发现DLBCL肿瘤B细胞中胆固醇合成、胆固醇转运及高胆固醇血症相关通路显著富集，且健康供者为主的B细胞亚簇中胆固醇代谢基因表达极低；随后利用TCGA队列的bulk RNA-seq数据验证了胆固醇代谢通路基因在DLBCL患者中显著高表达，提示过度活跃的胆固醇代谢参与DLBCL发病。

3.2 胆固醇代谢参与泽布替尼耐药。耐药患者与敏感患者B细胞的系统比较显示，耐药样本中胆固醇合成、转运和结合相关基因集显著上调，HMGCS1、HMGCR、CYP51A1等代表基因在耐药样本中平均表达水平更高；耐药样本独有的B细胞亚簇（Cluster 4和Cluster 8）表现出更强的胆固醇合成活性；伪时间分析显示胆固醇合成基因表达在耐药富集的转录状态分支中逐渐升高，提示胆固醇代谢程序与泽布替尼耐药表型相关。

3.3 胆固醇积累与泽布替尼敏感性降低有关。通过逐步增加泽布替尼浓度建立的耐药细胞系SU-RE表现出更大的脂滴面积和更高的游离胆固醇水平，且胆固醇合成限速酶HMGCR、HMGCS1和CYP51A1蛋白表达显著上调；使用高胆固醇环境培养敏感细胞可使其对泽布替尼的半数抑制浓度（IC₅₀）升高约3倍，并减弱凋亡诱导。scRNA-seq分析进一步显示耐药患者样本中巨噬细胞比例明显增高，且这些巨噬细胞的胆固醇合成与外排通路过度活跃，CD206⁺巨噬细胞中胆固醇合成基因与外排转运体ABCA1表达正相关，提示巨噬细胞可能通过胆固醇外排营造高胆固醇微环境而促进耐药。

3.4 阿托伐他汀与泽布替尼在体外具有协同作用。利用L1000平台在FDA批准的药物中筛选到阿托伐他汀，并在SU-RE和U-2932细胞中验证了联合治疗的协同杀伤效果（CI<1），同时凋亡标志物cleaved-PARP和cleaved-caspase 3增加。机制上，泽布替尼可抑制BTK磷酸化，并抵消阿托伐他汀引起的胆固醇合成酶代偿性上调，进而减少细胞内胆固醇和脂滴蓄积，增强抗淋巴瘤活性。

3.5 联合治疗在体内克服耐药。在U-2932异种移植小鼠模型中，泽布替尼与阿托伐他汀联用较任一单药显著降低肿瘤体积和生长速度，并降低肿瘤组织中的胆固醇含量；免疫组化显示联合治疗能够抑制肿瘤内HMGCS1、HMGCR和CYP51A1的表达，与体外结果一致。

3.6 AID抑制与联合治疗协同作用相关。bulk RNA-seq显示联合治疗组显著下调B细胞活化、适应性免疫调节和核染色质分裂等通路；与单药相比，联合治疗更明显地降低激活诱导胞苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AICDA/AID）的表达。scRNA-seq显示耐药DLBCL细胞的AICDA表达高于敏感细胞，且AICDA与胆固醇合成基因如HMGCS1呈正相关；免疫印迹和免疫组化进一步证实联合治疗在细胞系和移植瘤组织中均能有效下调AID蛋白水平，提示AID抑制可能位于胆固醇信号下游并参与联合治疗的协同机制。

讨论部分指出，脂代谢重编程在DLBCL进展和耐药中发挥关键作用；肿瘤相关巨噬细胞中增强的胆固醇合成与外排可能形成富胆固醇微环境，支持肿瘤细胞存活并削弱泽布替尼的疗效。阿托伐他汀与泽布替尼通过双重机制产生协同：一方面抑制胆固醇合成限速酶，另一方面阻断BTK信号并抑制胆固醇合成酶代偿性上调，最终减少胆固醇蓄积并下调AID，促进凋亡。本研究也存在局限性，如耐药患者样本数较少，巨噬细胞来源胆固醇的直接因果关系尚未完全证实，HMGCS1调控AID的分子机制仍需进一步基因扰动实验验证。研究结论为：数据分析支持胆固醇代谢增强与泽布替尼敏感性降低相关；肿瘤相关巨噬细胞的胆固醇合成和外排可能促进胆固醇富集的微环境，但其因果关系尚待证实；在临床前模型中，阿托伐他汀联合泽布替尼可降低肿瘤胆固醇含量、抑制AID/AICDA表达，并表现出优于单药的抗肿瘤活性。这些发现为该联合方案在DLBCL中的进一步机制研究和临床评估提供了临床前依据。