《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Hesperidin Attenuates Vincristine-Induced Nephrotoxicity via Nrf2/HO-1 and PI3K/Akt/mTOR Signaling
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长春新碱（VIN）是一种广泛使用的化疗药物，其治疗应用受到浓度依赖性毒性（包括肾毒性）的显著限制。本研究旨在表征橙皮苷（HES）在VIN诱导的肾毒性模型中的肾脏保护能力，并阐明其保护作用的机制。28只雌性Wistar白化大鼠分为四组：对照组、HES（200 m
长春新碱（VIN）是一种广泛使用的化疗药物，其治疗应用受到浓度依赖性毒性（包括肾毒性）的显著限制。本研究旨在表征橙皮苷（HES）在VIN诱导的肾毒性模型中的肾脏保护能力，并阐明其保护作用的机制。28只雌性Wistar白化大鼠分为四组：对照组、HES（200 mg/kg）组、VIN（0.17 mg/kg）组和VIN（0.17 mg/kg）+ HES（200 mg/kg）组，所有处理连续7天。研究人员评估了肾功能标志物、氧化应激参数、凋亡和自噬相关基因表达、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号组分以及组织病理学改变。VIN给药显著增加血清尿素和肌酐水平、脂质过氧化和氧化DNA损伤，同时降低抗氧化防御（p < 0.05）。VIN还诱导明显凋亡，表现为肿瘤蛋白p53（p53）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、Caspase-3和C/EBP同源蛋白（CHOP）表达增加以及B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）水平降低，同时自噬增强和PI3K/Akt/mTOR信号抑制（p < 0.05）。这些分子变化伴随严重肾脏组织病理学损伤（p < 0.05）。HES补充通过恢复抗氧化能力、减少炎性细胞因子、抑制凋亡、调节自噬相关基因表达并部分恢复PI3K/Akt/mTOR信号，显著减轻这些效应（p < 0.05）。组织病理学发现进一步证实HES对VIN诱导肾损伤的保护作用（p < 0.05）。总之，HES通过调节相互关联的氧化应激、炎症、凋亡、自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路，对VIN诱导的肾毒性发挥肾脏保护作用，提示其作为预防该实验模型中化疗相关肾损伤的多靶点药物的潜力。
研究背景与问题：长春新碱（vincristine，VIN）是治疗儿童白血病和多种实体瘤的常用化疗药，但临床使用受剂量依赖性毒性限制，其中包括肾毒性。既有实验证据显示，VIN可破坏肾功能，表现为血清尿素和肌酐升高，并扰动氧化还原稳态，促进肾脏炎症反应、氧化应激和凋亡细胞死亡。药物诱导肾毒性日益被认为是由氧化应激、炎症激活和凋亡相互作用驱动的多因素过程；化疗药等诱导的肾毒性模型中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量生成、脂质过氧化以及内源性抗氧化物如谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）耗竭，可放大炎症信号并激活肾脏线粒体依赖性凋亡通路。因此，靶向这些相互关联过程被认为有前景。橙皮苷（hesperidin，HES）是富含于柑橘类水果的生物活性黄酮，在多种肾损伤模型中显示抗氧化、抗炎和抗凋亡活性。在顺铂和环孢素诱导的肾毒性模型中，HES可改善肾功能、恢复抗氧化防御、减轻炎症反应，并调节凋亡信号。此外，HES及其衍生物可通过激活Nrf2/HO-1信号增强抗氧化损伤能力。然而，关于HES抗VIN肾毒性的证据仍有限，机制尚未完全阐明。基于此，研究人员开展本研究。
研究人员使用28只雌性Wistar白化大鼠（8–9周龄，180–200 g），来自Bingol University's Experimental Research Center，随机分为对照组、HES（200 mg/kg）组、VIN（0.17 mg/kg）组和VIN（0.17 mg/kg）+ HES（200 mg/kg）组，连续7天给药。第8天处死动物，采集血清和肾组织，评估肾功能、氧化应激、凋亡和自噬相关基因表达、PI3K/Akt/mTOR信号组分和组织病理学。研究得出结论：HES通过调节氧化应激、炎症、凋亡、自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路，对VIN诱导的肾毒性发挥肾脏保护作用，提示其可能作为该实验模型中预防化疗相关肾损伤的多靶点药物。
关键技术方法：研究使用28只雌性Wistar白化大鼠（来源：Bingol University's Experimental Research Center），随机分为对照组、HES 200 mg/kg组、VIN 0.17 mg/kg组和VIN+HES组，连续7天给药。检测血清尿素、肌酐；肾组织MDA、GSH、SOD、CAT、GPx、8-OHdG；ELISA检测PI3K、Akt、mTOR；qRT-PCR检测p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3、CHOP、LC3B、Beclin-1、ATG5、ATG7，以GAPDH为内参，采用2
?ΔΔCt法；Western blot检测HO-1、Nrf2、TNF-α、IL-1β；H&E染色行组织病理学半定量评分；统计采用Shapiro-Wilk、Levene、ANOVA/Tukey、Welch/Games-Howell、Kruskal-Wallis/Dunn检验。
研究结果：
3.1 血清尿素和肌酐水平：通过检测血清尿素和肌酐发现，VIN组二者较对照组和HES组明显升高（p < 0.05），提示肾功能受损；VIN+HES组较VIN组显著降低（p < 0.05），但仍高于对照组（p < 0.05），说明HES部分减轻VIN诱导的肾损伤。
3.2 肾脏DNA损伤和氧化应激标志物分析：通过检测肾组织氧化应激和抗氧化指标发现，VIN暴露使丙二醛（malondialdehyde，MDA）和8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）显著升高（p < 0.05），并使GSH、SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）显著降低（p < 0.05）。VIN+HES组MDA和8-OHdG低于VIN组，GSH、SOD、CAT、GPx高于VIN组（p < 0.05），但未达对照基线，提示HES仅提供部分保护。
3.3 VIN和HES对大鼠肾组织凋亡和炎症相关基因表达的影响：通过qRT-PCR检测发现，VIN使p53、Bax、Caspase-3和CHOP表达较对照组和HES组显著上调（p < 0.05），Bcl-2显著下调（p < 0.05），提示凋亡信号和内质网应激激活。VIN+HES组p53、Bax、Caspase-3和CHOP mRNA较VIN组显著降低，Bcl-2显著恢复（p < 0.05），但未完全达到对照值。
3.4 VIN诱导肾损伤中的自噬相关基因表达：通过qRT-PCR检测发现，VIN使LC3B、Beclin-1、ATG5和ATG7 mRNA较对照组和HES组显著上调（p < 0.05）。VIN+HES组这些基因较VIN组显著降低（p < 0.05），但仍高于对照（p < 0.05），提示HES对VIN诱导的自噬发挥部分调节作用。
3.5 VIN诱导肾损伤中PI3K/Akt/mTOR通路改变：通过ELISA检测发现，VIN使PI3K、Akt和mTOR水平较对照组和HES组显著降低（p < 0.05）；HES单独给药与对照相比无显著变化（p > 0.05）。VIN+HES组PI3K、Akt和mTOR较VIN组显著升高（p < 0.05），但未完全回到对照水平，提示HES部分恢复该通路。
3.6 VIN和HES对大鼠肾组织Nrf2/HO-1信号和炎症标志物的影响：通过Western blot检测发现，VIN使HO-1和Nrf2蛋白水平较对照组和HES组显著降低（p < 0.05），TNF-α和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）显著升高（p < 0.05）。HES单独给药较对照组显著升高HO-1和Nrf2（p < 0.05），TNF-α和IL-1β与对照相当（p > 0.05）。VIN+HES组HO-1和Nrf2较VIN组显著升高，TNF-α和IL-1β显著降低（p < 0.05），但未完全回到对照水平。结果表明HES至少部分通过调节Nrf2/HO-1信号减轻VIN诱导的氧化应激和炎症反应。
3.7 组织病理学发现：通过H&E染色和半定量评分发现，对照组肾组织形态正常；HES组肾实质结构维持。VIN组出现肾小球萎缩和坏死、间质充血、小管变性、上皮细胞损伤和透明管型形成。VIN+HES组病理损伤较VIN组明显减轻，肾小球结构大部分保留，间质充血减少，小管退行性改变缓解，仅少量萎缩小管残留。结果提示HES对VIN诱导的肾损伤具有保护作用。
讨论部分总结：讨论指出，本研究显示VIN诱导的肾损伤以炎症、氧化应激、凋亡、自噬失调和PI3K/Akt/mTOR信号紊乱为特征，HES补充可部分减轻这些改变，提示多靶点保护作用。血清尿素和肌酐是评估肾功能的既定生物标志物，VIN升高二者与既往报道一致，HES降低二者提示改善肾功能。VIN诱导肾毒性主要与ROS过量导致氧化还原稳态破坏有关；MDA和8-OHdG升高，SOD、CAT、GPx等抗氧化防御降低，可能与这些酶在解毒VIN诱导ROS中被过度消耗及GSH减少有关，8-OHdG升高反映氧化DNA损伤积累。HES恢复抗氧化物并降低MDA和8-OHdG。炎症和氧化还原敏感信号也参与其中，HES上调Nrf2和HO-1、下调TNF-α和IL-1β。VIN还通过协调激活线粒体和内质网应激通路诱导凋亡：p53、Bax、Caspase-3和CHOP上调、Bcl-2下降；Bax升高和Bcl-2降低提示线粒体凋亡通路激活，Caspase-3升高证实执行期凋亡，CHOP上调提示内质网应激介导凋亡。HES恢复Bax/Bcl-2平衡并降低Caspase-3和CHOP。VIN显著抑制PI3K、Akt和mTOR，提示关键促生存信号通路受抑；由于PI3K/Akt/mTOR轴调控细胞存活并负向控制自噬，其下调可能促成应激诱导自噬，LC3B、ATG5、Beclin-1和ATG7上调支持这一点。HES部分恢复PI3K、Akt和mTOR并减弱自噬相关基因，提示其保护作用可能涉及调节PI3K/Akt/mTOR自噬轴。组织病理学进一步证实VIN引起严重肾损伤，HES组显著减少病理改变。研究优势是采用互补的生化、分子和组织病理方法综合评估VIN肾损伤和HES保护作用，同时评估氧化应激、炎症、凋亡、自噬和PI3K/Akt/mTOR通路。局限性包括仅评估单一HES剂量、仅使用雌性大鼠，无法确定性别差异和剂量反应关系；部分分子结局主要在表达水平评估，需进一步功能和通路特异性研究验证机制。
研究结论翻译：总体而言，本研究表明，VIN通过一个相互关联的问题网络损伤肾脏：炎症、氧化应激、凋亡和紊乱的自噬，以及正常帮助细胞存活的PI3K/Akt/mTOR通路破坏。过度氧化应激，特别是ROS过载，似乎是主要触发因素。它引发连锁反应，损害线粒体，触发内质网应激，关闭促生存信号，同时增强应激诱导的自噬。这些分子问题得到肾功能标志物明显变化和显微镜下可见组织损伤的支持。重要的是，给予HES有助于逆转大多数这些问题。它恢复肾脏氧化还原平衡，减少炎症和细胞死亡，使PI3K/Akt/mTOR通路正常化，并将过度自噬重新控制，帮助保护肾脏细胞完整性。所有生化、分子和组织水平发现高度一致，强化了HES通过多靶点同时发挥作用的论点。总之，这些结果提示HES通过微调涉及氧化还原平衡、炎症、凋亡和自噬的复杂网络保护肾脏。它可能是减少患者化疗相关肾损伤的有前景策略。
