亚硒酸钠（Na2SeO3）通过GPX4介导抑制铁死亡改善去卵巢小鼠骨代谢紊乱

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：GPX4-Mediated Inhibition of Ferroptosis by Sodium Selenite Ameliorates Bone Metabolic Disorders in Ovariectomized Mice

　　

绝经后骨质疏松症（PMOP）及其相关骨折并发症，因全球人口老龄化迅速加速，已成为紧迫的公共卫生挑战。在氧化应激升高条件下，骨髓间充质干细胞（BMSCs）的功能衰退是公认的PMOP致病基石，使氧化还原失衡成为关键治疗节点。在此，研究人员证明亚硒酸钠（Na₂SeO₃）能强效对抗BMSCs中的氧化损伤，从而恢复并增强其成骨谱系定向分化。此外，RNA测序分析表明，铁死亡可能与该细胞反应机制相关。铁死亡主要由谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）介导，该硒酶作为其主要酶促抑制因子发挥作用。在BMSCs中沉默GPX4显著降低其成骨能力，同时上调铁死亡相关蛋白表达。值得注意的是，在GPX4受抑制条件下，Na₂SeO₃给药未能逆转这种损伤。这些发现提示，Na₂SeO₃主要通过上调GPX4表达从而抑制铁死亡来增强成骨分化。因此，研究人员通过识别硒调节骨代谢稳态的一种此前未被认识的分子轴，确立了Na₂SeO₃作为PMOP潜在治疗策略。

研究背景与意义：骨质疏松症（osteoporosis）是一种系统性代谢性骨病，特征为骨重塑失衡，临床表现为进行性骨量丢失和骨微结构退化，导致骨脆性增加和骨折易感。当前一线促骨形成方案主要使用甲状旁腺激素受体激动剂，尤其是teriparatide，但其临床受经济负担、治疗时长限制和依从性不佳制约。硒在促进骨再生方面有潜力，但传统硒治疗因治疗窗窄、剂量限制性全身毒性和缺乏高质量临床试验而受限。铁死亡（ferroptosis，铁依赖性致命性脂质过氧化驱动的调控性细胞死亡）在骨骼疾病中日益被认为是关键致病因素；成骨细胞过度脂质过氧化诱导凋亡，损害骨形成，并继发促进破骨细胞活化，加剧骨质疏松。谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）是唯一能还原磷脂氢过氧化物（phospholipid hydroperoxides, PLOOH）的硒蛋白，通过GPX4/SLC7A11/GSH轴清除脂质ROS，连接硒治疗与骨稳态。亚硒酸钠（sodium selenite, Na₂SeO₃）是临床常用无机硒补充剂，可纠正硒缺乏并发挥抗氧化和免疫调节功能，但硒摄入与骨质疏松负相关的分子机制未明。因此，研究人员聚焦Na₂SeO₃预防成骨细胞铁死亡及其抗骨质疏松治疗潜力。

研究开展、结论与意义：研究人员通过体外BMSCs（bone marrow mesenchymal stem cells，骨髓间充质干细胞）和体内OVX（ovariectomized，去卵巢）小鼠模型，发现Na₂SeO₃增强BMSCs成骨分化，RNA测序提示铁死亡相关；沉默GPX4削弱成骨并上调铁死亡蛋白，且在GPX4抑制条件下Na₂SeO₃不能逆转损伤。体内OVX模型中Na₂SeO₃减轻骨丢失并显示系统生物安全。结论为Na₂SeO₃主要通过上调GPX4表达抑制铁死亡，从而增强成骨分化，改善OVX小鼠骨代谢紊乱，提示其作为绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis, PMOP）潜在治疗策略，并识别硒调节骨代谢稳态的新分子轴。

关键技术方法概括：研究人员使用6周龄Sprague–Dawley大鼠来源原代BMSCs进行体外实验；使用8–10周龄雌性C57BL/6小鼠建立OVX模型，随机分组n=5，术后1周每日腹腔注射Na₂SeO₃ 0.05或0.1 mg/kg，连续14天，8周终点取材。关键技术包括CCK-8、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）与茜素红S（Alizarin Red S, ARS）染色、qRT–PCR、Western blotting、RNA-seq（Illumina/MGI平台，GENEWIZ）、JC-1、DCFH-DA ROS、丙二醛（malondialdehyde, MDA）/谷胱甘肽（glutathione, GSH）、FerroOrange、免疫荧光、GPX4小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）、分子对接、细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）、微计算机断层扫描（micro-computed tomography, micro-CT）、Calcein双标、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）及血清生化。

研究结果：
4.1 Na₂SeO₃增强BMSCs成骨分化并减轻体外氧化应激。通过CCK-8，0.1 μM Na₂SeO₃不影响BMSC增殖。在200 μM H₂O₂存在下，Western blotting显示Na₂SeO₃减弱H₂O₂对RUNX2、SP7、COL1A1等成骨标志物的抑制；ALP和ARS染色显示碱性磷酸酶活性及矿化结节形成增强；免疫荧光显示RUNX2和OCN荧光强度增强。结论：Na₂SeO₃恢复并增强H₂O₂损伤的BMSCs成骨能力，且高剂量效果更明显。

4.2 Na₂SeO₃干预有效抑制H₂O₂诱导的成骨细胞铁死亡。通过RNA-seq分析，200 μM H₂O₂和0.1 μM Na₂SeO₃处理72 h后，获得329个上调、336个下调基因；KEGG、GO和GSEA显示铁死亡信号通路及铁离子转运和稳态富集，Na₂SeO₃抑制铁死亡通路特征。以Ferrostatin-1（Fer-1，1 μM铁死亡抑制剂）为阳性对照，DCFH-DA显示Na₂SeO₃剂量依赖性减少ROS积累；MDA降低，GSH恢复，FerroOrange显示细胞内不稳定铁过载被消除；JC-1和总铁分析一致；Western blot和qRT–PCR显示铁死亡关键调节因子改变。结论：Na₂SeO₃通过抑制铁死亡保护BMSCs。

4.3 GPX4介导Na₂SeO₃体外调控成骨细胞功能。分子对接显示Na₂SeO₃与GPX4结合口袋具有有利互补性；CETSA显示Na₂SeO₃使GPX4熔解温度由43.44°C升至47.25°C，ΔTm=3.81°C，提示直接物理结合。siRNA沉默GPX4后，GPX4和SLC7A11表达降低；Na₂SeO₃上调GPX4和SLC7A11。siGPX4组RUNX2、SP7、COL1A1显著降低，后续Na₂SeO₃未能显著恢复这些蛋白；ALP和ARS显示Na₂SeO₃可恢复H₂O₂损伤的成骨功能，但GPX4敲低后该效应消失；ROS和MDA显示siGPX4+Na₂SeO₃无类似降低，GSH结果一致。结论：沉默GPX4完全阻断Na₂SeO₃抑制铁死亡和骨保护效应，GPX4是介导其作用的关键分子靶点。

4.4 亚硒酸钠减轻OVX诱导的体内骨丢失。通过OVX小鼠模型，术后1周每日腹腔注射Na₂SeO₃ 0.05或0.1 mg/kg，连续14天。micro-CT和三维重建显示OVX组小梁骨丢失，Na₂SeO₃增加骨小梁数量，高剂量获益更大；骨形态参数改善，骨孔隙率降低。H&E染色显示骨小梁数量和结构组织增加；Calcein双标显示矿化沉积平均厚度增加。心、肺、肾H&E未见明显形态异常；血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、肌酐（creatinine, Cr）无病理升高且处于正常生理范围。结论：Na₂SeO₃有效减轻OVX诱导的骨丢失，治疗剂量系统生物安全。

讨论部分总结：讨论部分指出，骨质疏松的中心致病驱动是骨重塑慢性失调，破骨吸收超过成骨形成；当前抗吸收药可抑制破骨、减缓骨丢失，但促进新骨形成有限，因此需要增强成骨的策略。Na₂SeO₃是常用无机硒补充剂，硒维持抗氧化防御、免疫调节和甲状腺激素代谢；但硒补充或富硒生物材料直接治疗骨质疏松仍缺乏高质量循证支持。Lourdes et al. 确认硒在抗氧化保护、免疫监视增强和细胞增殖调控中的关键作用。本研究中，H₂O₂处理BMSCs的成骨能力受损和ROS荧光升高可被0.05–0.1 μM Na₂SeO₃缓解；OVX模型结合H&E和micro-CT分析进一步证实Na₂SeO₃通过降低骨组织氧化应激增强成骨能力，从而治疗骨丢失；血清ALT、AST、BUN、Cr表明治疗剂量Na₂SeO₃具有系统生物安全性，无肝毒性或肾毒性。铁死亡核心机制涉及GPX4–SLC7A11轴功能障碍，导致GSH合成减少、脂质ROS清除失败和细胞膜崩解。Yuan X et al. 提出硒通过调节骨组织细胞铁死亡调控骨代谢；Yin Y et al. 显示硒通过升高GSH和SOD酶活性、降低MDA和铁含量、上调GPX4和SLC7A11抑制铁死亡。本研究显示Na₂SeO₃可能通过负调控铁死亡增强BMSCs成骨；以Fer-1为阳性对照，Na₂SeO₃抑制MDA形成、恢复GSH并消除细胞内不稳定铁过载。GPX4是硒蛋白，催化位点含硒代半胱氨酸（selenocysteine, Sec）；作为铁死亡中心分子屏障，GPX4兼具结构蛋白和抗氧化酶双重作用。Cao et al. 报道GPX4不仅调控铁死亡，也参与脂质和氨基酸代谢，影响细胞衰老、肿瘤发生和程序性细胞死亡。本研究沉默GPX4后BMSCs成骨能力显著受损，伴GPX4和SLC7A11降低，表明Na₂SeO₃通过上调GPX4抑制铁死亡促进BMSCs成骨分化。讨论还指出Na₂SeO₃诱导GPX4上调的精确机制仍不清楚；除分子对接提示的物理结合外，原文提出可能涉及翻译后稳定GPX4抗蛋白酶体降解、翻译水平增强GPX4合成以供应硒代半胱氨酸掺入、转录激活Nrf2/Keap1轴共上调GPX4和SLC7A11等。局限包括仅用H₂O₂体外模型可能未完全反映骨质疏松多因素病因，需在糖皮质激素诱导或年龄相关模型中验证；OVX动物观察期短，需纵向研究评估长期疗效和系统生物安全；研究仅聚焦BMSC成骨，评估Na₂SeO₃对破骨细胞介导骨吸收的直接影响是下一步关键。

研究结论翻译：本研究证明，Na₂SeO₃处理显著减轻氧化应激条件下BMSCs内ROS积累，同时增强其成骨分化能力。进一步机制研究表明，GPX4作为硒依赖性关键调节因子，通过抑制铁死亡通路调控细胞存活和成骨功能。为评估这些结果的转化潜力，研究人员在体内环境中研究其效应。在OVX小鼠模型中，亚硒酸钠同样表现出减轻骨丢失的疗效。这些结果的汇聚表明，亚硒酸钠的保护作用机制根植于抑制成骨细胞铁死亡，从而验证其作为骨质疏松靶向治疗干预的潜力。