《Journal of Neuroendocrinology》：Genetic intratumour heterogeneity in digestive high-grade neuroendocrine neoplasms
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消化道高级别神经内分泌肿瘤（digestive high-grade neuroendocrine neoplasms, HG-NEN）是罕见且异质性强的肿瘤，生物学行为侵袭性强，治疗效果有限。基因组瘤内异质性（genetic intratumour hete
消化道高级别神经内分泌肿瘤（digestive high-grade neuroendocrine neoplasms, HG-NEN）是罕见且异质性强的肿瘤，生物学行为侵袭性强，治疗效果有限。基因组瘤内异质性（genetic intratumour heterogeneity, ITH）是其他癌症进展和治疗耐药的机制，但在消化道HG-NEN中尚未被探索。研究人员对51例适合多区域采样的消化道HG-NEN进行了采用360-癌症基因panel的下一代测序（next-generation sequencing, NGS）。评估患者内每个样本的突变状态以计算ITH指数，该指数定义为样本间所有配对比较中不一致突变的平均数量。对化疗初治病例基于原发肿瘤样本计算ITH指数：28例神经内分泌癌（neuroendocrine carcinomas, NEC）、9例混合性神经内分泌-非神经内分泌肿瘤（mixed neuroendocrine-non-neuroendocrine neoplasms, MiNEN）和3例神经内分泌肿瘤3级（neuroendocrine tumour grade 3, NET G3）。NEC/MiNEN的中位ITH指数为5，范围宽（0–98.8）。更大的异质性与右侧结肠原发（p = .005）和更高的肿瘤突变负荷（tumour mutational burden, TMB）（r = 0.74，p < .001）相关。NEC/MiNEN中，中位ITH指数高于中位者相比低于中位者的中位总生存期（overall survival, OS）长7个月（22.5 vs. 15.5个月，p = .077），主要由局限区域病变患者驱动。一线化疗反应不受中位ITH指数影响。BRAF和KRAS驱动突变中未发现异质性。NET G3显示低异质性（ITH指数2–3）。较高的ITH指数未与较短生存或治疗反应相关，提示基因组ITH不是消化道NEC/MiNEN的主要耐药机制。在向靶向治疗策略迈进时，研究人员的数据表明单次活检可能低估ITH。BRAF和KRAS可能是有利的靶点，因为它们未显示异质性。
消化道高级别神经内分泌肿瘤（digestive high-grade neuroendocrine neoplasms, HG-NEN）罕见、异质性强、侵袭性高，常早期转移且预后差。多数患者诊断时已有转移，标准治疗为姑息化疗，但现有方案常出现快速疾病进展和短暂缓解，生存有限。随着分子特征逐渐明确，靶向治疗受到关注，而基因组瘤内异质性（genetic intratumour heterogeneity, ITH）可能影响靶向治疗疗效和可靠生物标志物开发。遗传ITH存在于多数癌症，常提示分支进化，并在一系列癌症中与不良预后和治疗耐药相关。但在消化道HG-NEN中，治疗反应差和生存差的原因未明，遗传ITH尚未评估。此前针对10例结直肠混合性神经内分泌-非神经内分泌肿瘤（mixed neuroendocrine-non-neuroendocrine neoplasms, MiNEN）的研究发现，神经内分泌癌（neuroendocrine carcinoma, NEC）成分与腺癌成分存在遗传差异，同时NEC成分内空间区域也存在遗传差异，提示一定ITH。因此，研究人员首次开展系统多区域分析，在大样本消化道HG-NEN中描绘空间遗传ITH程度，检验其是否贡献于治疗耐药和不良预后，以及是否成为靶向治疗疗效障碍。该研究具有重要临床意义：提示遗传ITH可能不是消化道NEC/MiNEN的主要耐药机制，单次活检可能低估ITH，而BRAF和KRAS驱动突变无瘤内异质性，可能成为有利靶点。
研究人员通过前瞻性NORDIC NEC 2研究和生物样本库开展研究，最终纳入51例消化道HG-NEN，包括34例NEC、14例MiNEN和3例神经内分泌肿瘤3级（neuroendocrine tumour grade 3, NET G3）。主要原发部位为结肠、直肠和胰腺。关键技术方法概括如下：样本来自七个北欧中心，2013–2017年收集，末次随访2021年；对福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE）肿瘤组织进行多区域取样，每例取2–4个区域，MiNEN取NEC成分，主要来自原发肿瘤，部分含区域淋巴结或远处转移；采用360-癌症基因panel进行下一代测序（next-generation sequencing, NGS）；ITH指数定义为患者内样本所有配对比较中不一致突变的平均数量；统计关联生存、治疗反应和临床变量。
研究结果如下。
3.1 消化道HG-NEN中的基因组瘤内异质性。研究人员对53例进行多区域靶向测序，2例经病理复评排除，最终51例。NEC/MiNEN中最常见突变为TP53、APC、NF1、BRAF、KMT2C、KMT2D、KRAS和RB1。42/48例NEC/MiNEN可计算ITH指数，37例化疗初治者为主队列。中位取样数为2，范围2–4；ITH指数与配对比较次数相关，但主要由2例微卫星不稳定高（microsatellite instability-high, MSI-H）病例驱动。主队列ITH指数范围0–98.8，中位5，仅1例为0。NEC与MiNEN中位ITH指数分别为4.7和9，差异无统计学意义。NET G3为低异质性，ITH指数2–3。右侧结肠原发者ITH指数显著更高，排除MSI-H后仍显著。年龄、吸烟、转移状态、Ki-67及NEC小细胞/大细胞亚型与ITH指数无显著关联。ITH指数与肿瘤突变负荷（tumour mutational burden, TMB）正相关，排除MSI-H后仍显著。化疗暴露与初治者ITH指数无显著差异。非原发部位样本中，原发加区域淋巴结者异质性指数为6–20，远处转移者异质性指数低，提示转移过程可能是进化瓶颈。
3.2 基因组ITH与生存和治疗反应。ITH指数高于中位者相比低于中位者，中位总生存期（overall survival, OS）长7个月，但差异未达统计学显著；按局限或转移分层后亦无显著差异；其他截断值未显示显著OS影响。在23例接受姑息化疗者中，OS和无进展生存期（progression-free survival, PFS）均不受中位ITH指数显著影响，一线化疗反应亦不受影响。调整共享突变的替代ITH指数与原指数强相关，OS亦无差异。
3.3 消化道驱动突变中的遗传异质性。在NEC/MiNEN中，TP53、APC、BRAF、KRAS和RB1驱动突变常见。选定驱动突变异质性低，仅5例出现异质性，且其中1例可能因肿瘤细胞纯度低。BRAF和KRAS突变未发现异质性。非原发部位样本中，除1例低纯度外，未见遗传异质性。对25个选定基因的更广泛分析显示，所有NEC/MiNEN均有至少一个驱动突变，46%存在驱动突变异质性，但不影响OS。
3.4 平行进化。近半数NEC/MiNEN病例显示平行进化，即同一基因内出现两个或以上突变。最常见于APC和NF1，TP53和RB1亦可见，但BRAF或KRAS未见平行进化证据。
3.5 与循环肿瘤DNA的比较。多区域测序可能遗漏空间限制性亚克隆，而循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA, ctDNA）理论上代表所有亚克隆。与既往ctDNA数据11例重叠病例比较，9/11例未发现ctDNA独有突变；例数虽少，但提示在NEC中增加ctDNA分析可能不会大幅增加所评分的遗传异质性。
讨论部分总结：高ITH在多种癌症中与治疗耐药和不良预后相关，但在消化道HG-NEN中此前未探索。本研究描述大样本消化道HG-NEN遗传ITH图谱，并检验其对生存和治疗反应的影响。化疗初治NEC/MiNEN中遗传ITH高度可变，除1例外均存在一定异质性，支持分支进化而非线性进化。常见消化道驱动突变异质性低，提示这些突变可能是早期驱动并贯穿肿瘤演化。患者间ITH差异原因未明，可能与分子亚群有关。右侧结肠原发、MSI-H和高TMB与更高ITH相关，符合结直肠腺癌中右侧肿瘤遗传不稳定更明显的认识；Ki-67与ITH无关，提示增殖率本身不是主要驱动。生存方面，高ITH未显著缩短生存，也未影响一线化疗反应，提示遗传ITH可能不是消化道NEC/MiNEN的主要耐药机制；NEC快速生长更可能反映主克隆在治疗开始时即具耐药特征。BRAF和KRAS无瘤内异质性，具临床意义；BRAF V600E是潜在靶点，尤其在结肠NEC中突变率较高；KRAS G12C虽少见但亦可考虑。BRCA2和PIK3CA等潜在可靶突变各在部分病例中显示异质性。McGranahan et al.在九大癌种中亦发现可靶驱动突变存在显著ITH，因此多活检评估异质性对避免低估突变谱和成功实施靶向治疗可能重要。研究限制包括ITH指数与配对比较次数相关、样本数受组织量限制、使用360基因panel、未评估全基因组、拷贝数改变、结构变异、时间异质性、多组学、肿瘤微环境及液体活检等。
研究结论翻译：据研究人员所知，这是首项评估消化道HG-NEN中遗传ITH的研究。消化道NEC和MiNEN原发肿瘤样本显示广泛的遗传异质性，较高异质性者呈现非显著性生存更好趋势。因此，遗传ITH可能不是这些患者治疗耐药的主要机制。BRAF和KRAS驱动突变未显示异质性，具有临床意义，因其为潜在治疗靶点。然而，在向消化道HG-NEN患者更靶向治疗方法迈进时，单次肿瘤活检可能低估潜在遗传ITH。
