《Neurobiology of Disease》：Cryo-EM advances in TDP-43 amyloid fibrils structure determination
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TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是一种DNA/RNA结合蛋白，其病理性聚集构成了一类被称为TDP-43蛋白病（TDP-43 proteinopathies）的神经退行性疾病谱系特征，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶变性（FTLD）和慢性创伤性脑
TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是一种DNA/RNA结合蛋白，其病理性聚集构成了一类被称为TDP-43蛋白病（TDP-43 proteinopathies）的神经退行性疾病谱系特征，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶变性（FTLD）和慢性创伤性脑病（CTE）。近年来冷冻电镜（cryo-EM）的突破性进展通过解析TDP-43淀粉样纤维（amyloid fibrils）的原子结构，彻底改变了研究人员对这些疾病的理解。这些结构见解对于阐明从功能性液-液相分离（LLPS）到不可逆固态聚集的转变过程至关重要。本综述整合了2019年至2026年间关键的冷冻电镜研究成果，涵盖了由全长低复杂度结构域（LCD）形成的纤维、疾病相关的核心片段、直接从患者组织中提取的纤维丝，以及不同结构多态体（structural polymorphs）的病理意义。这些发现不仅加深了研究人员从脑科学角度对TDP-43蛋白病发病机制的理解，也为开发特异性构象诊断方法和靶向治疗药物提供了重要的结构基础。
一、研究背景与现存问题
TDP-43蛋白病是一类以TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）异常聚集为特征的神经退行性疾病，涵盖肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶变性（FTLD）、慢性创伤性脑病（CTE）、阿尔茨海默病（AD）等多种疾病。TDP-43在超过97%的ALS病例和约50%的FTLD病例中均有涉及，但其病理聚集体的高分辨率三维结构长期未能确定。主要障碍在于TDP-43致病性C末端区域本质上是无序的，传统结构生物学技术如X射线晶体学和核磁共振波谱（NMR）难以有效解析。因此，阐明TDP-43从生理性液-液相分离（LLPS）向病理性固态淀粉样纤维转变的分子机制，成为该领域亟待解决的核心问题。
二、研究目的与意义
该综述旨在系统总结2019至2026年间冷冻电镜（cryo-EM）在解析TDP-43淀粉样纤维结构方面的关键进展，揭示不同来源纤维的原子级结构及其与疾病亚型的关联。这些成果不仅深化了对TDP-43蛋白病分子病理机制的脑科学理解，还为开发构象特异性诊断工具和靶向治疗药物奠定了重要结构基础。
三、主要关键技术方法
研究人员主要采用冷冻电镜单颗粒分析和螺旋重构技术，利用RELION程序进行淀粉样纤维特异性优化和高通量结构测定流程。对于体外重组纤维，通过调整缓冲条件诱导不同折叠构象；对于患者来源纤维，则直接从尸检脑组织（包括额叶皮质、运动皮质等区域）中提取天然纤维丝，利用冷冻电镜的三维分类功能分离混合样品中的不同构象变体，最终实现近原子分辨率的结构解析。
四、研究结果
4.1 全长低复杂度结构域的纤维构象
Li等人于2021年首次解析了完整C末端低复杂度结构域（LCD，残基F276-M414）形成纤维的结构，分辨率为2.68 ?。该纤维为单一原丝，由14条β链（β1-β14）组成，分为N端疏水区和C端极性区。该工作首次在近原子水平证明TDP-43的LCD可独立形成高度有序的淀粉样结构，其核心折叠模式与后续在患者脑组织中鉴定的结构高度相似，验证了LCD作为致病核心的假说。
4.2 TDP-43核心片段的多态性架构
Cao等人于2019年系统研究了C末端TDP-43片段在不同体外条件下形成纤维的能力，成功解析了四种不同的折叠构象：SegA片段（残基M311-Q360）呈现三种匕首状折叠，而携带家族性ALS突变A315E的SegBA315E片段（残基Q286-L331）则形成R形折叠。该研究首次实验证明TDP-43具有形成多种稳定淀粉样结构的固有潜力。Kumar等人发现新生TDP-43纤维本身不具备强播种活性，只有在纤维发生翻译后蛋白水解切割并暴露出特定片段后，才获得高效播种能力，其活性纤维核心由六条较短β链组成（残基G281-G351）。Sharma等人研究了全长TDP-43体外形成的纤维，发现核心结构（残基G305-G348）由五条β链组成，通过侧链而非主链氢键稳定，呈现出一种区别于经典希腊钥匙（Greek key）的“淀粉样钥匙”基序。
4.3 患者来源的TDP-43纤维结构
Arseni等人于2022年分析了FTLD-TDP B型患者额叶和运动皮质中提取的纤维，发现了一种由单一TDP-43原丝组成的相同纤维结构，其有序核心跨越LCD的残基G282-Q360，呈现新颖的双螺旋折叠，与所有既往报道的体外TDP-43纤维结构均无相似之处。这是首次将TDP-43结构多态性与人类疾病的临床异质性直接关联。2023年，同一团队解析了FTLD-TDP A型患者的纤维结构，该结构呈现前所未有的V形徽章折叠，并鉴定出两个翻译后修饰位点（R293的瓜氨酸化和单甲基化），首次建立了特定FTLD-TDP病理亚型与独特TDP-43纤维构象之间的一一对应关系。2024年，Arseni等人从C型患者脑组织中提取了TDP-43与膜联蛋白A11（ANXA11）的异源复合物，其中ANXA11的N末端片段（L39-Y74）与TDP-43的C末端核心（G282/G284-N345）以全新方式共组装形成独特的杂合折叠，揭示了蛋白质共聚集的新机制。
五、讨论与结论
讨论部分要点： 当前仍面临若干技术挑战：人脑组织资源稀缺且获取受限；同一患者病变脑区内常存在多种纤维束构型共存，增加了冷冻电镜数据处理的复杂性；现有研究多基于少数供体病例，缺乏建立可靠基因型-结构-表型关联的统计效力。此外，所有高分辨率结构模型仅聚焦于LCD区域，N末端结构域（NTD）和RNA识别基序（RRM1/RRM2）的归属尚不明确——它们可能在聚集过程中被蛋白酶切割，还是作为动态附着物保留在纤维表面？新兴技术如冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结合聚焦离子束（FIB）铣削技术，有望在近天然状态下观察细胞内蛋白质聚集体，弥合体外与体内结构之间的鸿沟。
研究结论部分翻译： TDP-43蛋白病是一类进行性和破坏性的神经系统疾病，其核心病理标志是神经元内TDP-43包涵体的异常聚集。冷冻电镜解析TDP-43淀粉样纤维的高分辨率结构已成为该领域的关键突破。本工作系统回顾了TDP-43淀粉样纤维结构分析的重要进展，包括全长低复杂度结构域的原子模型、疾病相关核心片段以及患者脑源性纤维，并讨论了不同结构多态体的病理意义。这些结构发现不仅从神经科学层面增强了对TDP-43蛋白病分子机制的理解，也为开发构象特异性诊断工具和药物靶点提供了关键结构基础。
