《Prenatal Diagnosis》：Genome-Wide NIPT With Fetal-Fraction Enrichment and BinDel: Clinical Cohort Evaluation of Microdeletion and -Duplication Detection
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目的：评估基于胎儿分数（fetal fraction, FF）富集的全基因组无创产前检测（genome-wide noninvasive prenatal testing, GW-NIPT）在检测低至1 Mb的临床相关拷贝数变异（copy number var
目的：评估基于胎儿分数（fetal fraction, FF）富集的全基因组无创产前检测（genome-wide noninvasive prenatal testing, GW-NIPT）在检测低至1 Mb的临床相关拷贝数变异（copy number variants, CNVs）方面的分析和临床表现。
方法：研究人员回顾性分析了2023年8月至2025年7月期间接受FF富集型GW-NIPT检测的10,501例单胎妊娠。CNV分析采用BinDel和WisecondorX软件进行。
结果：FF富集使平均FF提高至24%（增加2.4倍）。临床相关的CNVs，包括微缺失和微重复，可被检测至约1 Mb。该方法在所有母体体重指数（body mass index, BMI）类别中均表现出稳健的性能。重测率为0.95%，最终无法报告率为0.03%，且未出现因BMI导致的检测失败。该工作流程在常见非整倍体、罕见常染色体三体、性染色体非整倍体以及亚染色体CNVs方面展现出高观察灵敏度、特异性和阳性预测值。
结论：FF富集增强了孕早期GW-NIPT的分析分辨率，将亚染色体CNVs的检测范围扩展至约1 Mb，适用于不同患者群体，尽管在该范围的低端检测仍依赖于胎儿分数。这种方法拓宽了产前筛查的范围，同时保持了较低的检测失败率。所有阳性结果均需通过诊断性确认检测和适当的遗传咨询。
研究背景与意义
无创产前检测（noninvasive prenatal testing, NIPT）基于对母体血浆中胎儿来源游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）的分析，已彻底改变了常见非整倍体如21三体（T21）、18三体（T18）和13三体（T13）的产前筛查模式。荷兰TRIDENT研究和比利时全国性全基因组NIPT项目进一步证明，全基因组无创产前检测（genome-wide NIPT, GW-NIPT）在人群层面可行、稳健且临床有效。然而，循环cfDNA主要来源于胎盘细胞滋养层而非胎儿本身，限制性胎盘嵌合体（confined placental mosaicism, CPM）是NIPT假阳性的主要来源，尤其对于罕见常染色体三体（rare autosomal trisomies, RATs）。此外，大量临床意义的胎儿染色体异常源于亚染色体缺失和重复即拷贝数变异（copy number variants, CNVs）。致病性CNVs通常小于10 Mb，与先天性异常、智力障碍和神经发育障碍相关，其综合患病率约为1-2%，超过了几种常见三体的发生率。多数临床可干预的致病性CNVs小于5 Mb，而标准GW-NIPT对此尺寸范围的检测常面临挑战。可靠检测小于7 Mb的CNVs在技术上仍然困难，因为小CNVs产生的测序深度偏差微弱，易被生物噪声、母体cfDNA优势、随机读段分布以及低覆盖度全基因组测序的有限分辨率所掩盖。因此，亟需开发胎儿分数（fetal fraction, FF）富集和改进的生物信息学框架等方法来提升小尺寸临床相关微缺失和微重复的检测分辨率。
本研究旨在评估一种整合了FF富集技术的GW-NIPT方法在检测染色体异常（包括接近1 Mb的致病性CNVs）方面的分析和临床表现，为拓展GW-NIPT的临床应用提供证据。
关键技术方法
研究人员采用回顾性研究设计，纳入了2023年8月至2025年7月在爱沙尼亚Celvia CC实验室（位于塔尔图）接受NIPTIFY检测的10,501例单胎妊娠样本。核心技术包括：（1）FF富集策略：通过选择130-140 bp大小的cfDNA片段进行文库制备，实现约2.4倍的FF提升；（2）双算法CNV分析：联合使用靶向微缺失风险检测工具BinDel（4.0.0版）和非靶向CNV检测算法WisecondorX（1.2.4版），两者共享由1,000例经相同FF富集文库方案处理的整倍体NIPTIFY样本构成的参考集；（3）胎儿分数估算：男性胎儿基于Y染色体读数定量（FFY），女性胎儿采用PREFACE方法；（4）测序平台：在Illumina NextSeq 1000系统上进行80 bp单端测序。
研究结果
3.1 胎儿分数富集
研究人员通过对13例男性胎儿孕妇血浆样本进行技术重复测序发现，在130 bp片段长度处FF最高（27.7%），富集倍数达2.4倍。基于此，临床队列选用130-140 bp范围进行cfDNA富集。在临床队列中，男性胎儿的平均Y染色体来源FF为23.9%（中心95%参考区间：10.7%-39.0%），相较于欧洲大型人群数据集中的FF水平提高了约2.4倍。
3.2 临床表现
共分析10,473份样本，报告高风险发现244例（2.3%），其中21.7%的高风险病例缺乏确认数据。
3.2.1 常见三体
T21：检出68例，55例确认真阳性，3例假阳性，10例未确认。观察灵敏度100%，特异性99.9%，阳性预测值（positive predictive value, PPV）94.83%。
T18：检出23例，17例确认真阳性，4例假阳性，2例未确认。观察灵敏度100%，特异性99.9%，PPV 80.95%。
T13：检出12例，4例确认真阳性，7例假阳性，1例未确认。观察灵敏度100%，特异性99.9%，PPV 36.36%。
3.2.2 拷贝数变异
38份样本筛查阳性，11例确认真阳性，15例假阳性，12例未确认。观察灵敏度100%，特异性99.9%，PPV 42.31%。报告的CNVs包括26个缺失和21个重复，大小范围为0.5至75.8 Mb，确认的CNVs范围为1.2至75.8 Mb。最小确认CNV为1.2 Mb的NF1微缺失综合征。
3.2.3 罕见常染色体三体
63份样本筛查阳性，7例确认真阳性（T22: n=4; T9: n=2; T16: n=1），38例假阳性，18例未确认。观察灵敏度100%，特异性99.6%，PPV 15.56%。
3.2.4 性染色体非整倍体
单体X（X0）：23例检出，9例真阳性，11例假阳性，3例未确认。XXY：11例检出，9例真阳性，无假阳性。XXX和XYY各有少量检出。各亚类观察灵敏度和特异性均接近或达到100%。
3.3 消失双胎
15例消失双胎（vanishing twin, VT）病例中，33%初始NIPT检出染色体非整倍体。重复采样后，部分信号消失，最终2例信号持续存在并被报告，随访未见胎儿异常。所有VT病例均获得可报告结果，无无法报告情况。
3.4 无法报告率与BMI
100例（0.95%）需重新采样，原因包括结果不确定、FF降低、标准差（standard deviation, SD）升高、VT或低测序读数。重复检测后，3份样本仍无法报告，最终无法报告率为0.03%，均由持续高于预设阈值的SD值导致。研究队列平均BMI为24.4，FF富集后所有BMI范围内的FF值均保持在4%阈值以上，无因BMI升高导致的检测失败。
讨论与结论
本研究表明，FF富集结合优化软件可将标准GW-NIPT的CNV检测分辨率从7 Mb扩展至约1 Mb。通过选择130-140 bp的cfDNA片段，研究人员将中位FF提升至24%，使得能够检测接近1 Mb的CNVs，解决了79%致病性CNVs小于5 Mb这一临床重要缺口。增强的FF为临床适用性带来优势，尤其在T13和T18等z-score通常较低的疾病中。无论母体BMI如何，该方法均维持了一致升高的FF，消除了BMI相关的检测失败，这是标准NIPT实施的一个已知局限。此外，该方法在生物学复杂的妊娠中表现稳健，所有15例VT病例均获得可报告结果，最终无法报告率仅为0.03%，显著低于TRIDENT-2研究中报道的0.3%。
研究人员强调，GW-NIPT仍是一项筛查测试，阳性结果的阳性预测值需谨慎解读。RATs的PPV为15.6%，反映了大多数RAT信号代表CPM而非真正胎儿非整倍体的生物学现实。CNVs的PPV为42.3%，高于荟萃分析估计的33%-37%，但受限于样本量。这些结果强调，GW-NIPT阳性结果需要通过诊断性确认检测和多学科临床判断。
研究的局限性包括：21.7%的阳性筛查结果缺乏完整临床随访；由于未对筛查阴性妊娠进行主动随访，可能遗漏假阴性病例；约10,500例的队列规模对于单个亚7 Mb致病性CNV而言仍相对较小。尽管如此，所有样本均为常规临床环境中连续采集的真实标本，直接代表了真实世界的NIPT实践。
结论：FF富集解决了标准GW-NIPT的关键技术限制，将CNVs检测延伸至约1 Mb，减少了BMI相关的检测失败，并在VT妊娠中保持了性能。这些进展扩大了GW-NIPT在不同患者群体中的临床适用性。然而，GW-NIPT仍是筛查测试，更高的分辨率伴随着固有权衡：它降低了严重微缺失和微重复的漏检率，但也增加了与胎儿基因型不一致的发现。这种权衡在常规人群筛查中是否可接受，是需要国家项目在结构化的检测前后咨询框架内回答的问题。
