圈养美洲豹（Panthera onca）不孕症的综合生殖与细胞遗传学评估

《Veterinary Medicine and Science》：Integrated Reproductive and Cytogenetic Assessment of Infertility in a Captive Jaguar (Panthera onca)

　　

： 背景：受威胁猫科动物的迁地保护需要深入了解其生殖生物学，并对辅助生殖技术（ART）进行现实评估。然而，关于美洲豹（Panthera onca）在圈养条件下生殖限制因素的知识仍然匮乏。 目的：基于一次全面的单时间点评估，本研究采用临床、内分泌学、精液分析和细胞遗传学相结合的综合方法，调查欧洲动物园与水族馆协会（EAZA）计划推荐繁殖的一对圈养美洲豹繁殖对持续不孕的原因。 方法：两只动物均接受了全面的生殖与健康评估，包括生殖器检查、超声检查、血液学与激素谱分析。电刺激采精后评估精液质量，并采用常规染色、显带技术和荧光原位杂交（FISH）进行细胞遗传学筛查，以检测潜在的染色体异常。 结果：细胞遗传学分析显示，两只个体均具有标准的猫科核型（2n = 38），未发现非整倍体或结构性染色体重排的证据。雌性的临床与内分泌学评估未发现可能损害生育能力的异常。相比之下，雄性的精液评估显示射精量显著减少、精子浓度低、精子活力低且形态异常精子比例高，符合严重畸形精子症的诊断。 结论：综合来看，这些发现表明，尽管不存在遗传和一般临床上的繁殖禁忌，精液质量是成功自然繁殖的关键限制因素。在观察到的生殖状况下，ART的可行性需要通过精子选择和功能测定进行功能验证。本研究强调了将细胞遗传学与生殖评估相结合以支持圈养繁殖计划中循证决策的价值，并为美洲豹提供了新的细胞遗传学数据。

论文解读文章：

一、研究背景与问题提出

美洲豹（Panthera onca）作为大型食肉动物，因栖息地丧失与破碎化、猎物枯竭及人类直接干扰，已从其原有分布范围的大约54%区域消失，被国际自然保护联盟（IUCN）列为近危物种。在圈养条件下，欧洲动物园与水族馆协会（EAZA）通过欧洲濒危物种计划（EEP）协调美洲豹种群管理，旨在维持尽可能高的遗传多样性。然而，2025年EEP报告显示，欧洲圈养种群由41家动物园中的42只雄性和47只雌性组成，当年推荐的16对繁殖对中仅出生2只幼崽，繁殖成功率极低。由于许多个体的谱系数据不完整，平均亲缘关系和近交系数无法普遍应用于配对决策。尽管有协调管理，美洲豹的生殖生物学相较于狮子和猎豹等其他猫科动物仍研究不足，圈养繁殖失败的原因在许多情况下仍未明确。此外，虽然染色体异常已被认定为其他猫科动物不孕的诱因，但美洲豹缺乏全面的细胞遗传学特征描述，这限制了圈养繁殖计划中的诊断能力。本研究针对丹麦兰德斯雨林（Randers Regnskov）一只被EAZA计划推荐繁殖的圈养美洲豹繁殖对，尽管有规律的交配行为，但4年内未记录到任何妊娠，研究人员旨在通过综合多方法框架调查持续不孕的潜在原因。

二、研究内容与主要结论

研究人员对这对美洲豹实施了综合评估，涵盖临床检查、超声检查、内分泌学与血液学分析、精液采集与分析以及全面的细胞遗传学筛查。研究得出以下核心结论：雌性未发现可能损害生育能力的异常，其非妊娠黄体期确认了排卵活动正在进行，下丘脑-垂体-性腺轴功能正常，但未实现受精；雄性精液质量严重受损，表现为射精量减少、精子浓度低、精子活力显著降低及严重畸形精子症，这是自然繁殖失败的主要限制因素；细胞遗传学分析显示两只个体均为标准猫科核型（2n = 38），无非整倍体或结构重排，且本研究首次对美洲豹进行了分子细胞遗传学特征描述。研究意义在于：证明了综合生殖与细胞遗传学评估在圈养猫科动物不孕调查中的价值，为美洲豹提供了新的细胞遗传学参考基线，并为EEP管理提供了循证决策依据。

三、主要关键技术方法

研究人员采用以下关键技术方法：（1）临床与超声检查：对雌性进行经腹超声检查子宫和卵巢，对雄性进行睾丸超声检查并计算睾丸体积；（2）内分泌与血液学筛查：采集血清检测孕酮（P4）、总睾酮、甲状腺素及标准生化血液学参数；（3）精液采集与分析：在全身麻醉下通过电刺激采精法采集精液，评估射精量、精子浓度、活力、存活率及形态学；（4）细胞遗传学分析：从外周血白细胞培养制备中期染色体分裂相，采用吉姆萨常规染色、C显带、G显带、CMA₃/DAPI染色、Ag-NOR银染及端粒探针和28S rDNA探针的荧光原位杂交（FISH）技术。样本来自丹麦兰德斯雨林的一对圈养美洲豹，均为2014年出生、5月龄起饲养于该机构的个体。

四、研究结果

4.1 雌性生殖评估

外部生殖器形态正常，位置适宜交配。指检发现前庭-阴道交界处有一环周黏膜皱襞，仅容一指通过，可能为正常解剖变异或轻度先天性狭窄，虽不认为会损害诱导反射性排卵所需的阴道刺激，但需前瞻性监测其对未来妊娠中难产的潜在影响。超声检查未见子宫病理改变，双侧卵巢存在2–3毫米的小卵泡结构。血清孕酮超过40 ng/mL（检测上限），确认处于非妊娠黄体期，与近期排卵和活跃黄体功能一致。

4.2 雄性生殖评估

触诊睾丸质地正常，左侧长4.3厘米、右侧长4.1厘米，超声未见病理改变。阴茎易伸出，长2.5厘米，具阴茎棘。精液评估显示射精量仅1.3 mL，精子浓度33×10⁶/mL，总精子数42.9×10⁶，精子活力仅10%，前向运动级别为2级（0–5级标准）。形态学分析显示仅5%为正常精子，尾部缺陷占45%，顶体缺陷15%，小头畸形12%，巨头畸形9%，游离头部9%，中段缺陷5%。血清睾酮浓度为4.74 ng/mL，在参考范围内。

4.3 临床与血液学发现

两只动物均显示淀粉酶（雌2242 U/L，雄1966 U/L，参考301.2±149.1 U/L）和脂肪酶（112–113 U/L，参考4.44±3.3 U/L）显著升高，同时丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALKP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）和胆固醇低于圈养美洲豹参考组。尽管淀粉酶和脂肪酶升高通常与胰腺炎相关，但两只动物均无临床症状，推测可能与采血前摄入高脂餐有关。

4.4 雄性与雌性细胞遗传学评估

两只个体的核型均为2n = 38条染色体，按标准猫科排列分为A1–A3、B1–B4、C1–C2、D1–D4、E1–E3、F2–F3常染色体对和一对性染色体，未检测到染色体异常。C显带显示两性均具有强异染色质化的性染色体，并在E1染色体对着丝粒周围区域发现两个异染色质块。G显带在雄性和雌性中产生一致的带型，仅Y染色体呈较均质组成。CMA₃/DAPI染色显示端粒区域高度GC丰富信号，E1染色体短臂上检测到额外显著的GC丰富信号。端粒FISH确认（TTAGGG）_n重复序列正常分布于染色体末端，无端粒间序列，排除隐性重排。28S rDNA FISH与AgNOR染色一致鉴定E1染色体对短臂为活跃核仁组织区。本研究首次在美洲豹中应用C显带、CMA₃/DAPI染色及端粒和rDNA探针FISH，构成该物种新的分子细胞遗传学特征描述。

五、讨论与结论

讨论部分指出，雌性未发现可能损害生育能力的异常，其非妊娠黄体期确认排卵活动正常但未实现受精，支持不孕主要归因于雄性精液质量。雄性精液参数低于已发表的美洲豹电刺激采精参考范围下限，严重畸形精子症（仅5%正常形态）与低精子浓度和低活力共同构成多因素生殖损害。值得注意的是，仅畸形精子症本身并不必然排除美洲豹自然生育能力，但本案例中浓度和活力的同时降低使受精能力受到严重损害。研究局限性包括单次采精不足以区分慢性或暂时性生殖障碍、缺乏粪便糖皮质激素测量、形态学记录未细化亚型分级、未采用计算机辅助精子分析（CASA）等。关于ART前景，精子选择技术和功能测定应在最终排除ART前进行评估。细胞遗传学方面，本研究结果与已有美洲豹核型数据一致，与Ledesma等人报告的着丝粒指数差异可能反映制备质量或种群水平多态性。研究建议将微卫星或SNP基因分型纳入EEP管理以优化配对决策，并推荐将综合评估框架推广至其他特征不明的猫科物种。结论强调，精液质量是自然繁殖成功的关键限制因素，ART可行性需通过精子选择和功能测定验证，细胞遗传学筛查未发现繁殖禁忌，本研究为美洲豹提供了首次分子细胞遗传学特征描述和参考基线。