零售鸡肉中携带blaNDM-5与mcr-1的大肠杆菌基因组特征揭示两种不同的质粒组织形式

《One Health》：Genomic characterization of bla NDM-5- and mcr-1-positive Escherichia coli from retail chicken meat reveals distinct plasmid organizations

　　

碳青霉烯类和多黏菌素类抗生素是治疗多重耐药革兰阴性菌所致严重感染的关键抗菌药物。碳青霉烯耐药基因blaNDM和多黏菌素耐药基因mcr-1的全球传播正威胁着这些最后防线抗生素的有效性。从“同一健康”（One Health）视角出发，食用动物和零售肉制品可能成为耐药决定因子的储存库和传播载体。本研究调查了从零售鸡肉中分离的、同时携带blaNDM-5与mcr-1的大肠杆菌（Escherichia coli）的发生情况及其基因组特征，以评估其通过食物链传播的潜力。研究人员从中国宣城市的67份零售肉类样品中，仅从鸡肉样品中分离到两株同时携带blaNDM-5和mcr-1的美罗培南耐药大肠杆菌。抗菌药物敏感性试验和杂交全基因组测序显示，这两株菌分别属于ST155和ST165序列型，并呈现多重耐药表型。系统发育分析表明，这两株菌与全球数据库中携带blaNDM和/或mcr-1的相同序列型基因组在遗传上存在显著差异，提示这两株菌并非来源于当前数据集所代表的新近克隆传播。完整基因组分析揭示了blaNDM-5与mcr-1的两种不同质粒组织形式：一株菌将blaNDM-5和mcr-1分别携带于两个独立质粒上，而另一株菌则将两个耐药基因共同定位于一个可接合转移的IncHI2质粒上。比较基因组分析显示，这些质粒与来自人类、动物和食品来源的已报道质粒具有高度相似性。上述发现强调，禽类相关大肠杆菌可能作为重要耐药决定因子的携带者，具有质粒介导传播的潜力，凸显了开展一体化“同一健康”基因组监测的必要性。

一、研究背景与科学问题

碳青霉烯类和多黏菌素类抗生素是治疗多重耐药革兰阴性菌所致严重感染的最后防线药物。碳青霉烯耐药基因bla_NDM和多黏菌素耐药基因mcr-1的全球传播严重威胁着这些关键抗生素的临床有效性。新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）自2008年在印度新德里首次发现以来，已成为临床上最重要的碳青霉烯酶之一，其中bla_NDM-5是肠杆菌目细菌中流行最广、传播最广泛的变异型之一。与此同时，质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1的出现进一步削弱了多黏菌素的治疗效果。当碳青霉烯耐药与多黏菌素耐药决定因子在同一细菌宿主中汇聚时，将赋予细菌对两类关键抗生素的同时耐药，极大增加临床治疗难度。

从“同一健康”（One Health）视角来看，耐药菌和耐药基因可在人类、动物、食品和环境之间循环传播，食品生产链是耐药性传播的重要界面。尽管碳青霉烯类药物未被批准用于食用动物，中国也已禁止将黏菌素作为饲料添加剂使用，但在中国的食用动物和动物源性食品中仍持续检出携带bla_NDM的大肠杆菌（Escherichia coli），包括同时携带bla_NDM和mcr-1的菌株。零售鸡肉中碳青霉烯和多黏菌素耐药大肠杆菌的检出，提示其可能成为人类暴露的潜在来源。因此，在“同一健康”背景下，对食源性大肠杆菌中碳青霉烯与多黏菌素共耐药进行基因组表征，对于理解其通过食物链传播的潜力具有重要意义。

二、研究内容与主要发现

研究人员于2023年7月1日从中国安徽省宣城市3家超市和2家农贸市场采集了67份零售肉类样品，包括49份猪肉和18份鸡肉。通过美罗培南（2 mg/L）选择性平板筛选，从18份鸡肉样品中分离到两株美罗培南不敏感的大肠杆菌，命名为AH23MCE1和AH23MCE2，两株菌均来自同一超市（超市B）的不同鸡肉部位，而49份猪肉样品中未检出bla_NDM阳性菌株。PCR和测序证实两株菌均携带bla_NDM-5基因。

抗菌药物敏感性试验显示，两株菌对美罗培南（最低抑菌浓度MIC=4 mg/L）耐药，并对氨苄西林、头孢唑林、头孢噻肟、四环素、氯霉素、氟苯尼考、萘啶酸、环丙沙星、磷霉素和黏菌素等多种抗菌药物耐药，但对替加环素保持敏感。值得注意的是，AH23MCE1表现出广泛耐药（XDR）表型，对除替加环素外的所有测试抗菌药物均耐药。

全基因组测序和杂交组装获得了两个菌株的完整基因组序列。AH23MCE1含有一条4,830,429 bp的环状染色体和9个质粒（2,042–188,235 bp），属于ST155序列型；AH23MCE2含有一条4,645,689 bp的环状染色体和3个质粒（111,699–257,731 bp），属于ST165序列型。耐药基因组分析显示，两株菌均携带bla_NDM-5和mcr-1，此外还携带多种其他耐药基因，包括β-内酰胺类（bla_TEM、bla_CTX-M）、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类、大环内酯类、质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因、磺胺类、甲氧苄啶和磷霉素耐药决定因子。AH23MCE1还携带gyrA（S83L和D87N）和parC（S80I）染色体突变，与其高水平的环丙沙星耐药（MIC=64 mg/L）一致；而AH23MCE2缺乏这些染色体突变，但携带PMQR基因，与其低水平环丙沙星耐药（MIC=1 mg/L）相符。

完整基因组分析揭示了两株菌中bla_NDM-5和mcr-1的两种截然不同的质粒组织形式。在AH23MCE1中，mcr-1位于一个188,235 bp的IncHI2质粒pXMAHMCE1-1上，该质粒属于ST3-IncHI2型，携带14个额外耐药基因，但由于缺乏Tra1区域（traJ-traG-traI-traH-trhR-trhY-trhF-trhH-trhG）而未能通过接合试验转移。bla_NDM-5则位于一个独立的95,262 bp IncK2质粒pXMAHMCE1-3上，该质粒以bla_NDM-5为唯一耐药基因，与来自人类、家禽、犬和零售肉类等多种来源的NDM-5/NDM-9 IncK2质粒高度相似（>99.3%序列一致性和>92%覆盖率），并成功以6.35×10^-2的高接合频率转移至大肠杆菌C600。在AH23MCE2中，bla_NDM-5和mcr-1共同定位于一个257,731 bp的IncHI2质粒pXMAHMCE2-1上，该质粒携带大量耐药基因，保留了完整的接合转移区域（Tra1和Tra2），以4.77×10^-4的接合频率成功转移。

比较基因组分析显示，两个IncHI2质粒与其他来自人类、食用动物和犬的肠杆菌科细菌中携带bla_NDM-5/6或mcr-1的IncHI2质粒共享高度保守的骨架（>99.9%一致性），但耐药基因区域存在差异。mcr-1基因在两个IncHI2质粒中均插入到质粒骨架的一个保守区域，破坏了编码假设蛋白的同一开放阅读框，但插入位置相差3 bp。pXMAHMCE2-1携带的mcr-1-pap2片段为2,604 bp，两侧为2 bp直接重复序列（5′-AG-3′）；而pXMAHMCE1-1含有2,602 bp片段，两侧为5 bp直接重复序列（5′-AGTCT-3′）。两个质粒中的mcr-1-pap2结构均缺乏上游插入序列ISApl1。bla_NDM-5在两个质粒中均嵌入保守的移动遗传结构（ΔISAba125-bla_NDM-5-ble_MBL-trpF-tat-ΔcutA），但存在细微差异：在pXMAHMCE2-1中ISAba125被IS26截短，ISCR1位于完整cutA基因下游；在pXMAHMCE1-3中ISAba125被IS5截短，cutA被IS26截短。

系统发育分析方面，研究人员从NCBI数据库检索了属于ST155和ST165且携带bla_NDM和/或mcr基因的公开基因组。ST155数据集包含来自33个国家的241个基因组，中国贡献最大（131/241），来源涵盖人类、家禽、猪、野生鸟类、食品和环境样品。AH23MCE1与所有其他ST155基因组的最小核心基因组单核苷酸多态性（cgSNP）距离为74–4,803个SNP。ST165数据集包含85个基因组，主要来自亚洲（91.5%），中国占44个。AH23MCE2与其他ST165基因组的cgSNP距离为1,825–10,959个SNP。两株菌均未在当前数据集中找到密切相关的基因组，表明其遗传上不同于现有公开基因组所代表的克隆群体。

三、研究意义与结论

本研究从零售鸡肉中鉴定出携带bla_NDM-5和mcr-1的大肠杆菌，并揭示了这两种耐药决定因子的两种不同质粒组织形式：一种为分离共存（分别位于不同质粒），另一种为共定位（共同位于单一IncHI2质粒）。特别值得关注的是，可接合转移的IncHI2质粒pXMAHMCE2-1同时携带bla_NDM-5和mcr-1，可能促进碳青霉烯和多黏菌素两类关键抗生素耐药决定因子在食物链中的共同传播。由于此类质粒携带多种抗菌药物耐药基因，单一抗菌药物的暴露即可维持携带多个耐药基因的质粒，即使在没有直接碳青霉烯或黏菌素选择压力的情况下也是如此。这些发现强调，食品相关细菌可能作为重要抗菌药物耐药决定因子的携带者，凸显了涵盖食用动物、零售食品、人类和环境储存库的一体化“同一健康”基因组监测的重要性，以检测和监测具有潜在公共卫生意义的高风险耐药质粒的出现和传播。

本研究存在一定局限性，包括鸡肉样品数量较少（n=18）、鸡肉与猪肉样品数量不均衡（18 vs 49）、单日采样、零售点数量有限且局限于单一城市，以及每份样品仅基于菌落形态选择一个疑似大肠杆菌菌落，可能未完全捕获样品内的菌株多样性。未来研究应采用更大规模、系统化设计的采样方案，结合多菌落筛选、纵向监测和跨部门基因组表征，以更全面地评估碳青霉烯耐药大肠杆菌沿食物链的发生、多样性和传播潜力。