金属阳离子 Mg2? 和 Ca2? 是在循环压缩作用下保护变性成熟牛软骨免于疲劳破坏的主要介质

《Osteoarthritis and Cartilage》：Metal cations Mg2+ and Ca2+ are major mediators of synovial fluid protection against fatigue failure of devitalized immature bovine cartilage under cyclical compression

　　**摘要**
**目的**
目前尚不清楚哪种成分负责在循环压缩载荷作用下保护去活的不成熟牛软骨中的滑液（SF），以防止其发生疲劳损伤。基于先前的研究和初步筛选实验，我们假设Mg2+和Ca2+是滑液保护作用的主要介质，而成熟牛滑液中的主要蛋白质和脂质成分——牛血清白蛋白（BSA）、γ-球蛋白和表面活性磷脂（SAPL）则不是。我们进一步假设没有其他主要成分参与了这一保护作用。

**方法**
使用不成熟的牛股骨髁软骨样本进行了三项连续的体外实验。实验1（E1）比较了含有BSA、γ-球蛋白、SAPL、BSA + γ-球蛋白 + SAPL以及SF的培养液（每组10个样本）。实验2（E2）比较了含有Mg2+、Ca2+、Mg2+ + Ca2+、不含Mg2+或Ca2+以及SF的培养液（每组10个样本）。实验3比较了EDTA螯合的SF和未经处理的SF（每组8个样本）。这些样本在54.4 ± 1.3 N的载荷下（约4?4.5 MPa）接受2 Hz的循环压缩载荷，最多测试36,000个周期。疲劳损伤通过表面粗糙度、肉眼观察、偏光显微镜（PLM）和组织学方法进行评估。

**结果**
在E1中，10个BSA样本、10个γ-球蛋白样本、9个SAPL样本和10个BSA + γ-球蛋白 + SAPL样本均受损，而SF样本均未受损。在E2中，10个不含Mg2+和Ca2+的样本受损，而10个含Mg2+ + Ca2+的样本和10个SF样本均未受损；使用Mg2+时观察到部分保护作用（3个样本受损），使用Ca2+时也有部分保护作用（4个样本受损）。在E3中，8个EDTA螯合的SF样本受损，而SF样本全部未受损。所有表现出明显疲劳损伤的组的表面粗糙度（Ra）显著增加（所有p < 0.001），而在SF组、Mg2+组、Ca2+组和Mg2+ + Ca2+组中未检测到统计学上的显著变化（所有p ≥ 0.364）。

**结论**
Mg2+和Ca2+是循环压缩载荷下保护软骨免于疲劳损伤的主要介质（E2）。金属阳离子的螯合消除了这种保护作用（E3），而滑液的主要蛋白质和脂质成分（BSA、γ-球蛋白和SAPL），无论单独使用还是联合使用（E1），以及其他所有滑液成分（E3），均无法实现这种保护作用。

**引言**
滑液（SF）在维持关节软骨的摩擦学功能和长期完整性方面起着关键作用。传统上，滑液的保护作用主要归因于通过透明质酸（HA）和润滑素/表面层蛋白（SZP）等边界润滑剂来减少摩擦 [1]、[2]。先前的摩擦滑动研究表明，与磷酸盐缓冲盐水（PBS）相比，滑液确实可以降低摩擦系数 [3]、[4]。然而，这种效果远小于间质液加压的效果，后者分别可使摩擦降低约2倍和60倍 [5]，这表明边界润滑在控制关节软骨的低摩擦行为方面是次要的。最近越来越多的实验证据表明，滑液的主要功能是在反复压缩载荷下延缓软骨的疲劳损伤，而不仅仅是减少关节活动过程中的摩擦 [6]、[7]、[8]。Petersen等人 and Sise等人证明，在往复滑动接触下，滑液可以显著延缓软骨的疲劳损伤 [6]、[7]。特别是Sise等人发现，即使在摩擦系数降低的情况下，稀释的滑液中的软骨仍会遭受明显的磨损损伤，这表明滑液的保护作用并不直接与摩擦减少相关 [7]。但由于这些实验系统中仍然包含滑动因素，因此尚不确定滑液对软骨疲劳损伤的保护作用是否独立于滑动相关的润滑机制。为了解决这一局限性，我们最近开发了一种定制的动态压缩系统，消除了滑动现象，使不成熟的牛软骨仅承受纯循环压缩载荷 [9]。在这种条件下，PBS中的软骨迅速出现分层损伤，而成熟牛滑液中的软骨则保持完整，且滑液浓度降低时保护作用逐渐减弱。偏光显微镜（PLM）和组织学分析表明，损伤始终发生在中间层（MZ）。这些发现共同提供了强有力的证据，证明滑液在循环压缩载荷下独立于任何直接减少关节表面摩擦的作用来保护软骨免于疲劳损伤 [9]。

**重要提示**
这项最新研究的发现还为滑液保护成分的身份提供了机制上的限制。损伤始终发生在关节表面下方约200 μm的中间层（MZ）内，并且即使在没有滑液预处理的情况下，保护作用也在100分钟内显现 [9]。因此，负责这种保护的成分必须迅速到达中间层以增强细胞外基质（ECM）的韧性。这一观察结果表明，高分子量的成分（如HA，约10 MDa），以及由于强结合而主要位于关节表面的成分（如表面层蛋白/润滑素（SZP，又称PRG4））不太可能是导致保护作用的成分 [10]、[11]、[12]，因此更有可能的是低分子量的滑液成分，因为它们与ECM的结合能力有限。

**另一种可能的解释**
对于先前研究中观察到的滑液保护作用 [6]、[7]、[9]，相对于PBS而言，另一种合理的解释可能是滑液改变了软骨的机械硬度或流体传输行为，从而提高了其抗疲劳损伤的能力。然而，Sise等人在另一项研究中报告称，将不成熟的牛关节软骨暴露于滑液中并未显著影响其压缩机械性能或间质液加压效果，无论组织是否在滑液中预处理过，从而排除了这种解释 [13]。尽管Zhang等人 [9] 建立了机制上的限制，但具体负责减少中间层磨损倾向的滑液成分仍然未知。因此，本研究的主要目的是确定负责滑液对软骨疲劳损伤保护作用的成分。

**方法**
许多滑液成分可能被认为是软骨疲劳保护的潜在介质，包括蛋白质、脂质、糖胺聚糖、类固醇激素和金属阳离子 [14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。根据它们的分子量 [22]，这些物质预计可以在十几分钟内扩散穿过200 μm的距离，即使考虑到ECM的阻碍 [23]，这也远短于我们最近研究中滑液保护作用显现的100分钟时间尺度 [9]。这种传输动力学使得这些分子成为快速介导滑液对压缩疲劳损伤保护作用的合理候选者。

**初步筛选**
利用我们之前建立的循环压缩疲劳模型 [9]，初步筛选排除了几种主要的滑液成分（蛋白质、脂质、糖胺聚糖和激素）作为软骨疲劳保护的主要介质。随后使用胎牛血清（FBS） [24] 和最低必需培养基（MEM） [24] 进行筛选，确定镁（Mg2+）和钙（Ca2+）是主要的候选介质，这最终促成了本研究（详见补充材料）。

**假设**
基于这些初步结果，我们假设滑液在循环压缩载荷下对不成熟牛关节软骨防止分层磨损的保护作用主要是由金属阳离子Mg2+和Ca2+介导的，而不是由牛血清白蛋白（BSA）、γ-球蛋白或表面活性磷脂（SAPL）介导的（H1）。我们进一步假设没有其他主要滑液成分对其保护作用负责（H2）。为了验证这些假设，我们采用了之前的实验框架 [9]，并在一系列定义的测试溶液中研究了对不成熟牛软骨的疲劳损伤。

**实验设计**
本研究进行了三项连续的体外筛选实验，以确定负责在循环压缩载荷下保护不成熟牛关节软骨免于疲劳损伤的滑液成分。E1检测了生理浓度下的滑液候选蛋白质和脂质成分，通过在含有BSA（12 mg/mL [25]、[26]）、γ-球蛋白（11 mg/mL [27]、SAPL（0.355 mg/mL [28]）以及BSA + γ-球蛋白 + SAPL的培养液中测试软骨样本。

**结果**
总体视觉损伤结果总结在表1中。在E1中，10个BSA样本、10个γ-球蛋白样本、9个SAPL样本和10个BSA + γ-球蛋白 + SAPL样本均受损（图2A-D）。相比之下，36,000个周期后所有SF样本均未受损（图2E-H）。在E2中，10个不含Mg2+的样本和10个不含Ca2+的样本受损，而10个含Mg2+ + Ca2+的样本均未受损（图2I-L），这与SF对照组相当。在E3中，8个EDTA螯合的SF样本受损，而SF对照组未受损。所有表现出明显疲劳损伤的组的表面粗糙度显著增加（所有p < 0.001），而在SF组、Mg2+组、Ca2+组和Mg2+ + Ca2+组中未检测到统计学上的显著变化（所有p ≥ 0.364）。

**讨论**
E1和E2的结果支持H1，表明滑液在循环压缩载荷下对软骨疲劳损伤的保护作用主要是由金属阳离子Mg2+和Ca2+介导的（E2），而不是由主要蛋白质和脂质成分BSA、γ-球蛋白和SAPL介导的（E1）。在E1中，BSA、γ-球蛋白、SAPL及其组合未能再现未经处理的滑液的保护作用。在E2中，从mDPBS中去除Mg2+和Ca2+后，保护作用消失。

**资金来源**
资助方并未参与研究设计、数据收集、分析或解释、文章撰写或决定发表。

**作者贡献**
HZ、JHW、GAA：概念设计和实验设计。HZ、JHW、ML、SD、MB：数据收集和整理。HZ、JHW、GAA：数据分析和解释、文章起草。CTH、GAA：资金获取。CTH、GAA：实验材料准备。所有作者：对文章的重要内容进行关键修订并最终批准文章。

**致谢**
本研究得到了美国国家关节炎和肌肉骨骼与皮肤病研究所（R01 AR073289）和美国国家普通医学科学研究所（R01 GM083925）的支持。内容仅代表作者的观点，不一定代表美国国立卫生研究院的官方立场。作者感谢哥伦比亚大学生物医学工程系的X. Edward Guo教授提供PLM实验室设施的使用权。

**利益冲突声明**
无