《Osteoarthritis and Cartilage》：Development and Characterization of a Rat Model of Post-traumatic Ankle Osteoarthritis
编辑推荐：
目的： 创伤后踝关节骨关节炎（posttraumatic ankle osteoarthritis, PTAOA）的分子机制尚不明确。研究人员建立了一种由关节不稳诱导的PTAOA大鼠模型，并评估了疼痛及病理变化，重点关注滑膜组织——这一在骨关节炎（osteoa
目的： 创伤后踝关节骨关节炎（posttraumatic ankle osteoarthritis, PTAOA）的分子机制尚不明确。研究人员建立了一种由关节不稳诱导的PTAOA大鼠模型，并评估了疼痛及病理变化，重点关注滑膜组织——这一在骨关节炎（osteoarthritis, OA）中发挥关键致痛作用的结构。
方法： 研究人员通过切除距腓前韧带（anterior talofibular ligament, ATFL）和跟腓韧带（calcaneofibular ligament, CFL）诱导踝关节不稳（RAC组）。采用番红O（Safranin-O）及苏木精-伊红（hematoxylin & eosin, H&E）染色评估组织学改变，同时开展疼痛相关行为学评估。对背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）进行批量RNA测序（bulk RNA sequencing），对滑膜组织进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing），以探究PTAOA的分子变化。
结果： 与假手术（Sham）对照组（n=8）相比，RAC组大鼠（n=8）踝关节出现软骨丢失（均差[Mean Difference, MD]=0.52，95%置信区间[CI]：-0.019至1.060）和滑膜炎（MD=2.24，95% CI：1.473至3.009）。PTAOA大鼠同时出现疼痛表现。RNA测序揭示，TGF-β–MAPK/PI3K-Akt–CTGF信号轴及THBS2–FN1轴在PTAOA滑膜组织中被激活。尤其值得注意的是，在人成纤维细胞培养中抑制THBS2表达可降低纤维化标志物的表达。最后，与安慰剂组相比，全身给予美洛昔康（meloxicam）可减轻PTAOA大鼠的疼痛（MD=50.4，95% CI：4.8至96.1）（每组n=8）。
结论： 本研究阐明了PTAOA中滑膜组织的病理变化，并鉴定了参与其中的关键信号通路。研究结果为管理PTAOA提供了新的治疗靶点。此外，本研究建立的PTAOA模型可作为临床前模型，用于测试潜在的治疗方案。
论文解读
一、研究背景与问题
创伤后踝关节骨关节炎（posttraumatic ankle osteoarthritis, PTAOA）是一种退行性关节疾病，其对健康相关生活质量的损害程度与膝骨关节炎（knee osteoarthritis, knee OA）相当。由于踝关节OA主要影响年轻、活动量大的个体，因此对日常活动、工作和运动参与造成显著影响。此外，终末期踝关节OA与整个下肢的代偿性步态机制相关，并降低动能交换效率，从而增加控制运动所需的肌肉负荷。踝关节也是运动中最常受伤的关节，约78%–90%的踝关节OA病例可归因于踝关节扭伤等创伤。然而，由于对PTAOA分子机制的了解有限，目前尚无能够改变其病程进展的药物。
既往已有啮齿动物踝关节OA模型的报道，但均未能在评估疼痛相关行为改变和滑膜组织变化的同时，全面再现PTAOA的病理特征。滑膜炎症（即滑膜炎）已被报道先于软骨退变出现，并与膝OA的疼痛和疾病进展相关。鉴于上述知识空白，研究人员旨在通过切除距腓前韧带（ATFL）和跟腓韧带（CFL）建立PTAOA大鼠模型，该操作可重现踝关节扭伤中常见的损伤模式。选择大鼠而非其他啮齿动物，是因为其体型允许进行精确的踝关节手术、清晰的行为学疼痛追踪以及基于关节腔注射的疗法测试。
二、研究设计与主要结论
研究人员通过切除ATFL和CFL（RAC手术）诱导大鼠踝关节不稳，在术后10周和20周收集踝关节进行组织学检查，并每隔一周进行疼痛相关行为学评估，持续至术后20周。结果显示，RAC组大鼠出现轻度软骨丢失（OARSI评分升高）和显著的滑膜炎（滑膜炎评分升高），并在术后2周即开始出现疼痛表现，表现为PAM测试中缩爪阈值降低和SWBSP测试中手术侧肢体负重减少。该模型成功再现了人类踝关节OA的关键临床特征——负重时疼痛和患肢负重减少。值得注意的是，该模型中的负重差异（约35克）远大于小鼠膝OA模型（约2克），与既往大鼠模型（约30克）相当，表明该大鼠PTAOA模型能更灵敏地检测手术或治疗干预引起的负重改变。
在分子层面，DRG批量RNA测序发现炎症相关通路、细胞对皮质类固醇的反应以及细胞外基质发生变化，qRT-PCR确认了Trpv1、Cacna1b和Ret基因在RAC组DRG中表达上调。TRPV1促进伤害感受器过度兴奋，由Cacna1b编码的CaV2.2促进伤害性突触传递，RET介导的神经营养信号可能通过调节TRPV1活性促进持续性感觉神经元敏化。滑膜组织单细胞RNA测序鉴定出至少14种细胞类型，其中最显著的变化是成纤维细胞群体在RAC组中比例增加（Sham组14.26% vs RAC组29.17%），谱系轨迹分析确认成纤维细胞向更晚的假时间状态转变。RAC组成纤维细胞表现出更高的炎症和纤维化评分，TGF-β信号通路显著富集（NES=1.99，校正后p=0.005），结缔组织生长因子（Ctgf）基因上调。细胞间通讯分析揭示了ANNEXIN、WNT、纤连蛋白（FN1）和血小板反应蛋白（THBS）等分子介导的相互作用，其中Fn1和Thbs2基因在RAC组成纤维细胞中上调。体外实验表明，在人成纤维细胞中敲低THBS2表达可下调纤维化相关标志物（COL1A1、CTGF、ACTA2、VCAN）的表达，Western blot结果进一步证实了这一发现。最后，美洛昔康（一种非甾体抗炎药）治疗实验显示，在RAC组中，美洛昔康治疗在PAM测试中提高了缩爪阈值（MD=50.4，95% CI：4.8至96.1），在SWBSP测试中减少了双后肢负重差异（从约40克降至约27克，MD=-37.17，95% CI：-59.35至-14.98），表明该模型对急性镇痛治疗具有响应性。
三、关键技术与方法
本研究采用的主要关键技术方法包括：①手术方法——在16周龄雄性Wistar大鼠（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）上切除ATFL和CFL诱导PTAOA，假手术组仅切开皮肤和关节囊，每组8只大鼠；②组织学评估——番红O/固绿染色评估胫距关节软骨退变（OARSI评分），H&E染色评估胫距关节前侧滑膜的滑膜炎评分，由两名不知分组信息的评估者独立评分；③疼痛行为学评估——PAM测试（压力应用测量装置评估踝关节机械性痛觉过敏）、SWBSP测试（静态负重+拉绳测试评估双后肢负重差异）和Von Frey测试（评估50%缩足阈值）；④DRG批量RNA测序——收集L5背根神经节，2-3只大鼠的DRG合并为一个生物学重复（n=3），使用RNeasy Plus Universal Kit提取总RNA后进行测序；⑤滑膜组织单细胞RNA测序——将7只大鼠的滑膜组织合并为一个样本（n=1），经酶消化制备单细胞悬液后通过10x Genomics平台进行单细胞转录组分析；⑥体外功能实验——使用siRNA在人成纤维细胞中敲低THBS2表达，通过qRT-PCR和Western blot检测纤维化标志物表达变化；⑦药物干预实验——术后6周，对Sham和RAC大鼠分别给予含美洛昔康（0.5 mg/天，口服）或安慰剂的培根味颗粒，连续给药2天，每组8只大鼠，共32只。
四、研究结果
RAC手术诱导大鼠踝关节软骨退变和疼痛： 术后10周，RAC组出现轻度软骨丢失（OARSI评分：Sham组0.89 vs RAC组1.41，MD=0.52，95% CI：-0.019至1.060）和显著滑膜炎（滑膜炎评分：Sham组0.57 vs RAC组2.81，MD=2.24，95% CI：1.473至3.009）。胫骨前侧和中侧区域软骨厚度在RAC组中变薄。术后20周样本观察到类似的软骨退变和滑膜炎症趋势。疼痛行为学方面，RAC组早在术后2周即出现PAM测试缩爪阈值降低和SWBSP测试手术侧肢体负重减少，持续至20周。Von Frey测试在各时间点均未观察到组间一致性差异。
RAC大鼠DRG中疼痛和炎症相关基因表达增加： 批量RNA测序鉴定出92个上调和179个下调基因，通路分析显示炎症相关通路、细胞对皮质类固醇反应以及细胞外基质发生变化。qRT-PCR确认Trpv1、Cacna1b和Ret基因在RAC组DRG中表达上调（MD=1.405、1.557和2.601，95% CI：0.05232至2.757、0.2736至2.840和0.1975至5.004）。
RAC大鼠滑膜组织中成纤维细胞群体显著增加： 单细胞RNA测序鉴定出至少14种细胞类型，成纤维细胞比例从Sham组的14.26%增至RAC组的29.17%。谱系轨迹分析显示成纤维细胞从祖细胞样状态向更晚的假时间状态转变。
RAC大鼠滑膜成纤维细胞纤维化和炎症增加： 成纤维细胞差异表达分析显示97个上调和179个下调基因，KEGG分析表明MAPK和PI3K-Akt信号通路在RAC组中更活跃，基因集富集分析显示TGF-β信号通路显著富集。RAC组成纤维细胞炎症和纤维化评分均显著升高，Ctgf基因上调，IHC确认RAC组软骨中CTGF蛋白水平升高。
滑膜组织中成纤维细胞与其他细胞类型之间的活跃串扰： 细胞间通讯分析显示RAC组中ANNEXIN、WNT、FN1和THBS等信号通路的通讯强度改变。Fn1和Thbs2基因在RAC组成纤维细胞中上调，假时间依赖性表达动态显示这些细胞外基质相关基因在OA进展过程中逐渐激活。IHC确认RAC组滑膜组织中FN1和THBS2蛋白水平升高。体外敲低THBS2可下调COL1A1（MD=-0.5640）、CTGF（MD=-0.7990）、ACTA2（MD=-0.9000）和VCAN（MD=-0.6652）的表达，Western blot结果一致。
美洛昔康减轻大鼠踝关节OA疼痛： 在RAC组中，美洛昔康治疗在PAM测试中提高了缩爪阈值（MD=50.4，95% CI：4.8至96.1），在SWBSP测试中减少了双后肢负重差异（MD=-37.17，95% CI：-59.35至-14.98）。Sham组中安慰剂和美洛昔康治疗之间无显著差异。
五、讨论与结论
讨论部分总结： 本研究中PTAOA模型的软骨退变程度较轻，这与既往小鼠PTAOA模型的结果一致，可能归因于踝关节软骨的内在韧性——踝关节软骨含有比膝关节软骨更高水平的蛋白聚糖和水分，这有助于其更大的刚度。此外，纤连蛋白片段在膝关节软骨中引起显著的蛋白聚糖丢失，但在相同暴露时间内对踝关节软骨影响甚微。在疼痛评估方面，本研究中踝关节PAM测试的缩爪阈值（200-300克）远低于既往报道的膝OA模型（约330-450克），表明踝关节比膝关节具有更高的敏感性。Von Frey测试未检测到组间差异，提示该PTAOA模型中可能未发展继发性异常性疼痛。DRG中Trpv1、Cacna1b和Ret基因表达上调提示外周敏化和伤害性神经传递增强。TGF-β–MAPK/PI3K-Akt–CTGF信号轴和THBS2–FN1轴在PTAOA滑膜组织中被激活，表明滑膜纤维化的产生。既往研究已证明THBS2调节FN1、COL1A1和α-SMA等纤维化标志物的表达，本研究结果与此一致。滑膜纤维化与OA大鼠的疼痛敏感性正相关，且血管生成与感觉神经生长密切相关，THBS2在调节血管生成中的已知作用提示其可能通过改变滑膜神经血管微环境促进疼痛相关感觉神经萌发。研究局限性包括：仅纳入雄性大鼠，未解决潜在的性别特异性差异；未评估手术前后的身体活动；社交饲养对疼痛敏感性的潜在影响无法排除；SWBSP评估需要隔夜禁食，导致美洛昔康给药方案不同于PAM测试，可能造成观察到的镇痛效果差异。
结论： 研究人员通过手术切除成功建立了大鼠踝关节OA模型，表现为软骨退变、滑膜炎和疼痛。研究强调了DRG中Trpv1和Cacna1b基因在疼痛通路中的关键作用，以及滑膜组织中TGF-β–MAPK/PI3K-Akt–CTGF信号和THBS2–FN1信号在创伤后踝关节OA中的参与。该模型为识别治疗踝关节OA的新治疗靶点提供了机会。鉴于该模型对美洛昔康的明确响应性，研究人员将进一步评估其在测试恢复踝关节结构完整性和/或减轻疼痛的治疗方案中的实用性。
