《Pharmacological Research》：Alpha-ketoglutarate ameliorates systemic sclerosis-associated fibrosis by restoring endothelial function
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α-酮戊二酸（alpha-ketoglutarate, α-KG）在博来霉素（bleomycin, BLM）诱导的纤维化肺和转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）刺激的成纤维细胞中呈矛盾性升高，但具有功能保护
α-酮戊二酸（alpha-ketoglutarate, α-KG）在博来霉素（bleomycin, BLM）诱导的纤维化肺和转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）刺激的成纤维细胞中呈矛盾性升高，但具有功能保护作用。口服α-KG给药可减轻临床前系统性硬化症（systemic sclerosis, SSc）模型中的皮肤和肺纤维化，减少炎症并改善生存。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）鉴定内皮细胞，尤其是动脉内皮细胞，为α-KG抗纤维化作用此前未被认识的主要细胞靶点。机制上，α-KG恢复内皮血管生成功能和屏障完整性，抑制TGF-β/Smad信号传导，逆转脂肪酸氧化缺陷，并通过上调核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1, NRF1）保留线粒体嵴结构。
系统性硬化症（systemic sclerosis, SSc）是一种致残性自身免疫性疾病，估计患病率为每百万人100至300例，以多器官过度纤维化和炎症为特征，尤其累及皮肤和肺。肺受累表现为间质性肺病（interstitial lung disease, ILD）和肺动脉高压（pulmonary hypertension, PH），是SSc相关死亡的首要原因。当前临床管理主要集中于症状缓解和免疫抑制，但这些策略很少阻止疾病进展或逆转已形成的纤维化，超过70%的患者在诊断后5年内出现不可逆器官损伤。因此，亟需靶向潜在纤维化机制的新疗法。纤维化日益被认为不仅是异常细胞因子信号和细胞外基质沉积的结果，也是代谢调节过程。基质细胞、免疫细胞和血管细胞在组织损伤期间经历显著代谢重塑，涉及糖酵解、三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环活性、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）、脂肪酸代谢和线粒体功能改变。代谢中间体还可通过调节表观遗传酶、氧化还原平衡、炎症反应和细胞命运决定而发挥超出经典生物能量作用的功能。α-酮戊二酸（alpha-ketoglutarate, α-KG）是TCA循环关键中间体，也是2-氧戊二酸依赖性双加氧酶（2-oxoglutarate-dependent dioxygenases）的必需辅底物，参与缺氧信号、DNA和组蛋白去甲基化以及胶原脯氨酰羟化。既往证据提示α-KG可改善压力超负荷诱导的心脏纤维化、β-肾上腺素受体激活诱导的心肌纤维化和四氯化碳诱导的肝纤维化，并可抑制促炎细胞因子产生。较早的离体研究报道二甲基α-酮戊二酸（dimethyl α-ketoglutarate, DM-αKG）在SSc皮肤外植体中具有抗炎和抗纤维化反应。然而，内源性α-KG在SSc相关纤维化中是否改变、外源性α-KG能否在体内减轻多器官疾病、以及哪些细胞区和下游通路介导其作用，仍未解决。因此，研究人员首先分析BLM诱导的纤维化肺和TGF-β刺激的成纤维细胞中的能量代谢中间体。α-KG在两种情况下均一致且矛盾性升高，促使研究人员假设这种升高代表不足的代偿反应，外源性补充可能增强该反应以限制纤维化进展。随后，研究人员使用互补的体外和体内模型，试图确定口服α-KG是否减轻临床相关BLM诱导SSc模型中的皮肤和肺纤维化；阐明α-KG调节的分子通路，尤其关注TGF-β/Smad信号和炎症级联；使用scRNA-seq鉴定α-KG的主要细胞靶点；评估α-KG对纤维化组织线粒体超微结构和代谢基因程序的影响。通过整合靶向代谢组学、批量与单细胞转录组学、蛋白质组学和功能验证，该研究提供了α-KG在SSc中抗纤维化作用的多层次机制解析，并鉴定内皮细胞为代谢干预此前未被充分认识的细胞靶点。该论文发表在《Pharmacological Research》。
关键技术方法概括：研究使用BLM诱导的小鼠皮肤和肺纤维化模型，并给予口服α-KG。人血浆样本来自上海中医药大学附属上海市中西医结合医院，包括SSc患者15例和健康对照16例。主要技术包括靶向能量代谢组学、批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、基于参考的细胞类型去卷积、Olink血清蛋白质组学、酶联免疫吸附试验（ELISA）、实时定量PCR（RT-qPCR）、免疫印迹、免疫组织化学、Masson染色、H&E染色、透射电子显微镜（TEM）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖/划痕/成管功能实验以及siRNA介导的NRF1敲低。
研究结果：
3.1 α-KG在BLM诱导的纤维化小鼠和TGF-β诱导的成纤维细胞中呈矛盾性升高。通过靶向能量代谢组学，研究人员发现BLM诱导的纤维化肺中α-KG显著升高，并位于变化最显著的代谢物之列；TGF-β刺激的永生化人二倍体成纤维细胞（IHDFs）中细胞内α-KG也显著升高。α-KG是体内和体外模型中唯一一致且显著上调的代谢物。SSc患者血浆α-KG水平显著高于健康个体。DM-αKG处理可显著降低TGF-β诱导的IHDFs中升高的胶原表达，提示α-KG可能调节成纤维细胞活化。
3.2 α-KG减轻BLM诱导的肺炎症并重塑炎症转录组。通过口服α-KG治疗BLM诱导的肺炎症小鼠，研究人员发现α-KG逆转BLM诱导的体重下降，减轻免疫细胞浸润和F4/80阳性巨噬细胞浸润，降低肺组织Tnf-α、Il-1β和Il-6 mRNA水平及血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。免疫印迹显示α-KG抑制BLM诱导的NF-κB和p38 MAPK信号激活，降低p-IKKα/β、p-P65和p-P38水平。批量RNA测序显示，BLM上调7,473个基因、下调2,375个基因，其中约23%（2,255个基因）被α-KG逆转；通路富集显示BLM激活炎症通路并抑制OXPHOS和脂肪酸生物合成，α-KG逆转这两条轴，恢复代谢通路并减弱炎症信号。
3.3 α-KG减轻BLM诱导的肺纤维化并重塑纤维化转录组和血清蛋白质组。在BLM诱导的肺纤维化阶段给予α-KG后，BLM组小鼠体重显著下降，α-KG治疗可缓解；21天观察期内，BLM组37.5%小鼠死亡，而对照组和BLM+α-KG组无死亡，α-KG显著改善生存。Masson染色显示BLM肺中胶原沉积明显，α-KG显著减轻；免疫组织化学显示Col1a1、α-SMA和p-Smad2染色减少，提示TGF-β/Smad活化受抑。胶原相关基因Tgfb1、Col1a1、Col1a2、Col3a1和Fn1在BLM肺中上调，α-KG可逆转；免疫印迹证实α-KG抑制BLM诱导的Col1a1、α-SMA和p-Smad2过表达。转录组分析中，3,637个BLM扰动基因中有1,078个被α-KG显著逆转；KEGG GSEA显示BLM激活炎症和增殖程序并抑制氧化代谢程序，α-KG产生近乎镜像的反转。Olink血清蛋白质组学发现BLM上调26个蛋白、下调8个蛋白，α-KG逆转10个BLM上调蛋白，包括Ccl20、Il10、Eda2r、Gdnf和Pla2g4a，并恢复5个BLM下调蛋白，即Dll1、Epcam、Epo、Flrt2和Vsig2；这些蛋白富集于TNF信号和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。
3.4 scRNA-seq分析揭示内皮细胞为α-KG的主要细胞靶点。对对照组、BLM组和BLM+α-KG组肺组织进行scRNA-seq，保留29,434个高质量细胞，鉴定出B细胞、T细胞、髓系细胞、NK细胞、内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、肺泡2型（AT2）细胞和肥大细胞九类主要群体。BLM升高成纤维细胞活化评分，α-KG显著降低该评分；Npnt?成纤维细胞显示BLM诱导活化并可被α-KG减弱，而Dcn?成纤维细胞无差异。由于scRNA-seq样本量有限，研究人员使用BisqueRNA对批量RNA-seq进行细胞类型去卷积，发现BLM降低估计的内皮、AT2和NK细胞比例并增加髓系比例；α-KG仅显著恢复内皮细胞比例，从2.9±1.5%恢复至8.2±1.3%，而髓系、NK和AT2比例趋向对照。差异表达分析显示，内皮细胞尽管数量较少，但在BLM+α-KG与BLM比较中具有最多差异表达基因，提示其为α-KG主要细胞靶点。内皮细胞进一步分为动脉内皮细胞、Aerocytes和静脉内皮细胞，动脉内皮细胞样簇最大；三种亚型中，BLM抑制脂肪酸ω-氧化和细胞色素P450介导的氧化通路，α-KG恢复这两类通路。髓系细胞中，BLM扩增Mmp12?巨噬细胞和迁移性树突状细胞，α-KG部分逆转；五个最响应亚群的α-KG反应一致，并共享溶酶体、吞噬和抗原加工基因及Spp1下调。糖酵解评分在三种内皮细胞亚型和六个髓系亚群中升高，α-KG使十个亚群中的九个显著恢复至对照方向，提示α-KG正常化BLM诱导的内皮和髓系区室糖酵解偏移。
3.5 α-KG增强内皮细胞血管生成功能和屏障完整性。免疫组织化学显示BLM肺中内皮标记CD31表达降低，α-KG显著恢复。在HUVEC中，BLM降低细胞活力，α-KG共处理逆转该抑制；BLM增加ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达，α-KG降低二者，提示减轻内皮炎症活化。成管实验显示α-KG增强HUVEC血管生成能力，并显著缓解BLM诱导的成管抑制；划痕实验显示α-KG显著挽救BLM抑制的HUVEC迁移和伤口闭合。BLM降低内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）蛋白表达，α-KG largely恢复；紧密连接蛋白ZO-1和Occludin同样被BLM抑制并被α-KG挽救。这些数据表明α-KG在纤维化应激下保护内皮增殖、迁移、血管生成能力和屏障完整性。
3.6 α-KG保留线粒体超微结构并增加NRF1，但其内皮保护不依赖NRF1。透射电子显微镜显示BLM诱导明显的线粒体嵴断裂和基质肿胀，并降低线粒体密度；α-KG治疗显著改善这些超微结构异常，恢复嵴结构并增加线粒体密度。免疫印迹显示α-KG在BLM处理肺中显著上调NRF1，提示促进线粒体生物发生。为探讨NRF1作用，研究人员在内皮细胞中进行NRF1敲低后再给予α-KG；siNRF1组中COL3A1和VIM mRNA表达变化及成管能力与siNC对照组趋势相同，表明NRF1沉默后α-KG仍可发挥保护作用，NRF1并非α-KG作用的唯一或不可或缺的下游介质。
3.7 α-KG减轻BLM诱导的皮肤炎症和纤维化。在BLM诱导的皮肤纤维化模型中，纤维化皮肤中α-KG含量也趋于高于对照。每日口服α-KG显著降低BLM升高的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平；H&E染色显示α-KG显著减轻BLM诱导的皮肤增厚，免疫组织化学显示BLM处理皮肤中F4/80阳性巨噬细胞浸润增加，α-KG治疗减少该浸润。Masson染色显示BLM处理皮肤中大量胶原沉积，α-KG显著减少；BLM诱导皮肤Col1a1、p-Smad2和α-SMA表达，α-KG均抑制。结果表明α-KG在肺和皮肤两个主要SSc靶器官中均具有广泛抗纤维化活性。
讨论部分总结：研究人员在本研究中鉴定α-KG为BLM诱导的纤维化肺和TGF-β刺激成纤维细胞中矛盾性升高的代谢物，并证明外源性α-KG补充可减轻临床相关SSc模型中的肺和皮肤纤维化。通过整合批量与单细胞转录组学、蛋白质组学和功能实验，研究人员提名内皮细胞为α-KG的主要细胞靶点，并显示α-KG抑制经典TGF-β/Smad信号，同时恢复线粒体完整性和脂肪酸相关氧化代谢。既往工作已表明α-KG改善压力超负荷诱导的心脏纤维化、β-肾上腺素受体激活诱导的心肌纤维化和四氯化碳诱导的肝纤维化，且离体SSc皮肤外植体scRNA-seq研究报道DM-αKG具有抗炎和抗纤维化反应。在此基础上，本研究有三项贡献：第一，在覆盖肺和皮肤两个主要靶器官的SSc相关模型中证明体内疗效，回应疾病多系统性质；第二，通过scRNA-seq与批量转录组去卷积整合，鉴定内皮细胞为α-KG主要细胞靶点；第三，结合靶向代谢组学、批量与单细胞转录组学、蛋白质组学、超微结构成像和功能实验，提供多层次机制解析，将内源性α-KG动态、内皮细胞特异性代谢重编程和TGF-β/Smad抑制联系起来。讨论指出，谷氨酰胺代谢在纤维化中的报道看似矛盾：GLS1是谷氨酰胺分解限速酶，由TGF-β在成纤维细胞中诱导，谷氨酰胺分解为肌成纤维细胞分化所需，并通过α-KG依赖性mTORC1激活和脯氨酰羟化支持胶原合成；而α-KG补充在多个器官和本研究中具有抗纤维化作用。这些观察并非必然不相容：GLS1控制谷氨酰胺进入通路，其抑制除α-KG外还扰乱谷氨酸、谷胱甘肽、核苷酸和脯氨酸代谢，而补充提高单一下游代谢物。讨论进一步解释，α-KG在系统性红斑狼疮、酒渣鼻和心力衰竭中也升高，甚至在补充可改善心脏纤维化的情境中升高，提示α-KG既是代谢应激标志，也是容量有限的代偿反应，而非疾病驱动因素；患者血浆中α-KG升幅约为1.3倍，相对药理剂量较小，且全组织浓度不能说明单个细胞类型尤其内皮细胞中可用α-KG量。研究人员指出未测定给药后α-KG暴露或α-KG通量，未来需同位素示踪研究。内皮细胞作为主要靶点与SSc血管病变作为早期关键事件的认识一致：毛细血管稀疏、血管生成受损和内皮屏障功能障碍先于明显纤维化，并促进慢性组织缺氧和异常成纤维细胞活化。α-KG在体内恢复CD31表达，并在BLM攻击的HUVEC中挽救增殖、迁移、成管、eNOS表达和紧密连接完整性。机制上，α-KG特异性恢复动脉内皮细胞中脂肪酸ω-氧化和细胞色素P450介导的氧化通路，与内皮稳态依赖脂肪酸氧化（fatty acid oxidation, FAO）相一致。糖酵解重编程是SSc纤维化特征，支持胶原合成和活化成纤维细胞及炎症细胞效应表型；单细胞数据显示BLM增加内皮和多数髓系亚群糖酵解评分，α-KG在十个亚群中的九个逆转该偏移，并伴随Hif1a、Pkm、Ldha和Pgk1等经典糖酵解基因一致变化；该效应具有区室特异性，成纤维细胞无糖酵解偏移，T和NK细胞在α-KG后评分增加。讨论提出一种可能机制是α-KG作为脯氨酰羟化酶必需辅底物，促进HIF-1α降解，从而降低糖酵解基因转录，但这些是小鼠模型转录特征而非糖酵解通量测量，需细胞外酸化和HIF-1α功能缺失实验验证。尽管α-KG抑制TGF-β/Smad信号、保留线粒体超微结构并增加NRF1，外源性α-KG如何启动这些效应仍未完全明确。单细胞数据支持细胞内摄取而非受体介导感知：α-KG受体Oxgr1（GPR99）在内皮细胞中不可检测，在任何肺细胞群体中表达低于0.4%，而线粒体2-氧戊二酸载体Slc25a11表达良好，尽管scRNA-seq可能低估低表达受体。TGF-β/Smad信号抑制可能为间接，例如通过TβRI周转、Smad磷酸酶活性或TETs和KDMs等2-氧戊二酸依赖性双加氧酶，但这些途径尚未测试。此外，NRF1敲低未废除α-KG对成管的保护作用，表明NRF1与内皮反应相关但非必需；由于未在敲低后测量线粒体质量和呼吸，不能排除NRF1在线粒体效应中的作用。研究人员最初优先研究肺纤维化，因为ILD是SSc患者死亡首要原因，但SSc是多系统疾病，皮肤纤维化既是标志也显著增加疾病负担，因此扩展至BLM诱导皮肤纤维化。α-KG显著减轻皮肤增厚、胶原沉积、巨噬细胞浸润和TGF-β/Smad活化，与肺部效应一致。两个主要SSc靶器官抗纤维化活性汇聚，支持α-KG作为候选系统性抗纤维化剂而非器官限定干预。除机制外，α-KG作为内源性代谢物具有已确立的人体膳食补充剂安全性，且近期临床证据表明钙α-KG补充可有利调节成人生物衰老标志物，这些特征共同支持其转化开发。讨论也指出局限：BLM诱导纤维化模型虽成熟，但不能完全重现人SSc复杂发病机制，尤其自身免疫成分和慢性血管病变，因此转化意义需谨慎解释；未来需使用互补模型如Fra-2转基因、cGVHD、人源化系统和患者来源组织验证。此外，未直接测试α-KG功能缺失；需对α-KG代谢酶进行遗传操作并结合稳定同位素示踪以确立必要性。皮肤胶原通过组织学而非羟脯氨酸测定评估，肺免疫印迹因组织不足每组仅限三只动物。尽管如此，抗纤维化效应在实验系统中汇聚以及多组学分析提供的机制深度，支持α-KG作为纤维化疾病进一步治疗开发的有前景候选。
研究结论翻译：总之，研究人员将α-酮戊二酸（α-KG）鉴定为SSc相关纤维化中具有功能保护作用的代谢物，并证明外源性α-KG补充可在临床相关模型中减轻肺和皮肤纤维化。通过整合多组学分析与功能测定，研究人员提名内皮细胞为α-KG此前未被认识的主要细胞靶点，其保护作用通过恢复血管完整性、维持线粒体稳态以及有效抑制TGF-β/Smad信号轴介导。鉴于其作为内源性代谢物且已确立人体安全性，α-KG值得作为系统性硬化症的代谢治疗策略进一步开展临床前验证和临床评价。
