基于人工智能的囊胚评估：缩短复温方案与脂肪酸补充对存活率和代谢功能的影响

《Reproductive BioMedicine Online》：Artificial intelligence-based blastocysts evaluation: impact on viability and metabolic function of shortened warming protocol and fatty acid supplementation

　　

摘要

研究问题

缩短的复苏方案和使用脂肪酸（FA）补充的复苏溶液是否会影响囊胚的体外活力，评估方法包括基于人工智能（AI）的图像分析和代谢学终点指标？

设计

一项体外实验研究，评估456例研究捐赠的玻璃化冷冻人囊胚，根据复苏方案（常规方案与缩短方案）和溶液类型（含与不含FA补充）分为四组。该研究结合了复苏后囊胚动态的人工标注、AI评估以及荧光定量分析，包括凋亡、坏死、脂滴、线粒体活性和出芽培养测定。

结果

总体复苏后存活率为98.5%。AI评分在玻璃化冷冻–复苏后有所下降，但在培养后部分恢复（所有P < 0.0001），各组之间无差异。缩短方案组的坏死显著增加（P ≤ 0.0166）。复苏后的AI评分与坏死呈负相关（t值 ≤ -3.33，所有P < 0.01）。与对照组相比，FA-常规方案组的脂滴含量增加（P ≤ 0.0455）。缩短方案在12小时内降低了线粒体膜电位（P ≤ 0.0048）。在常规方案下FA补充增强了线粒体活性，在缩短方案下部分恢复了线粒体活性（P ≤ 0.0240）。分层分析显示，与传统方案相比，缩短方案在C级质量胚胎中的出芽面积较小（P = 0.0179）。Life Whisperer Viability? AI评分与黏附率和出芽面积相关（P ≤ 0.0184），而Embryo Assist? AI评分与出芽面积和退化率相关（P ≤ 0.0180）。

结论

缩短的复苏方案增加了低质量囊胚的坏死，损害了线粒体活性，并减少了体外出芽面积。FA补充支持了线粒体恢复。基于AI的评分反映了与坏死相关的损伤，可能使其无需侵入性评估。需要更大规模的研究来验证这些发现。

引言

自胚胎玻璃化冷冻标准化并引入常规临床实践以来（Loutradi 等，2008），其使用大幅增加，同时冻胚全移植策略也在扩展。根据ESHRE数据，2020年有85,807例（19.1%）周期为冻胚全移植，298,562例（38.3%）为冻胚移植（FET）周期，共获得78,456例活产（欧洲人类生殖与胚胎学会欧洲试管婴儿监测联盟，2025）。在日本，2022年57.5%的周期为冻胚全移植，FET占移植总数的89.2%（Katagiri 等，2024）。因此，优化玻璃化冷冻和复苏技术的需求日益增长，以期改善临床结局、提高时间效率并简化实验室工作流程。

实现这一目标的策略包括完善冷冻保护剂溶液和操作流程、确定胚胎质量标志物、应用人工智能（AI）和计算机视觉，以及玻璃化冷冻和复苏的自动化。关于复苏培养基的组成，补充长链脂肪酸（FA）已被广泛研究（Ohata 等，2021；Amagai 等，2023；Ezoe 等，2024a；Sawado 等，2024）。脂滴在细胞增殖、信号传导和线粒体β-氧化中发挥重要作用，β-氧化是FA代谢和ATP产生的主要途径（Li 等，2023）。FA补充旨在恢复细胞内脂质含量并防止能量耗竭，因为囊胚扩张和细胞分裂需要ATP，而在玻璃化冷冻过程中ATP会减少（Ohata 等，2021）。在复苏胚胎的体外实验研究中，FA补充与更大的出芽面积和更低的退化率相关（Amagai 等，2023；Sawado 等，2024）。在临床上，它改善了妊娠和活产结局，且未产生不良产科或围产期影响（Ezoe 等，2024a；Sawado 等，2024）。然而，即使FA供应充足，对于线粒体活性受损的胚胎，通过β-氧化产生能量可能仍然不理想（Sawado 等，2024）。此外，玻璃化冷冻后立即观察到mtDNA拷贝数出现短暂下降，在复苏后培养过程中恢复（Perez-Sanchez 等，2023），这表明复苏和复苏后培养条件可能影响线粒体功能。

近年来，针对卵母细胞和胚胎的新型缩短玻璃化冷冻和复苏方案已相继推出（Gallardo 等，2019；Liebermann 等，2024）。对于胚胎复苏，这些缩短方案通常涉及在非渗透性冷冻保护剂（CPA），如海藻糖或蔗糖的溶液中暴露1分钟，以诱导脱水并促进渗透性CPA的去除。相比之下，常规方法需要10–15分钟并依次使用三种不同浓度非渗透性CPA的溶液。这些更短的程序提供了实际效益，包括提高工作效率和简化胚胎学实验室的日常操作。然而，缩短暴露的主要优势在于限制囊胚暴露于非生理温度的时间，并减少接触潜在有毒CPA的时间，从而在便利性的基础上提供了关键的生物学效益（Liebermann 等，2024；Martinez-Rodero 等，2025）。多项临床研究报道，缩短复苏不会损害存活率、发育潜能、临床妊娠或活产率，且与不良围产期结局无关（Jiang 等，2024；Fucci 等，2025；Karagianni 等，2025；Lammers 等，2025；Liebermann 等，2026）。体外分析也显示细胞谱系标记物的表达相似（Lammers 等，2025）以及黏附能力相当（Shioya 等，2025）。相反，我们小组近期的一项体外研究观察到缩短复苏后坏死发生率增加，可能是由于细胞过度水化所致（Ezoe 等，2025）。这种效应可能反映了非渗透性CPA溶液与复苏培养基之间的急剧渗透压变化，导致快速水分流入囊胚腔和卵裂球（Pedro 等，1997）。相比之下，使用多步骤常规方案逐步稀释CPA有助于防止这种渗透压应激。

FET周期的优化也从基于AI的胚胎质量评估工具中获益，这些工具超越了传统的形态学评估，提供了客观、全面的分析。AI系统在评估玻璃化冷冻囊胚方面展现了潜力，在特定条件下提供与经验丰富的胚胎学家相当的复苏后存活率和临床结局预测（Ueno 等，2021；Marsh 等，2022；Conversa 等，2024；Ueno 等，2024；Conversa 等，2025）。AI驱动的图像分析是研究不同胚胎复苏方案效果的有力工具，因为它能够比较玻璃化冷冻前和复苏后的胚胎形态（VerMilyea 等，2020；Loewke 等，2022）。虽然玻璃化冷冻前或复苏后立即评估为早期干预提供了机会，但证据表明，在培养约2–3小时后获得的图像评分与临床结局的相关性更强（Conversa 等，2024）。此外，采用深度学习的AI模型可能检测到肉眼无法察觉的图像特征，可能包括与坏死灶或脂滴分布相关的模式，通过识别细微的像素级变化。

基于上述背景，本体外实验研究使用基于AI的图像分析评估新开发的缩短复苏方案及FA补充复苏溶液，与不含FA的常规复苏进行比较。通过整合复苏后形态动力学标注与凋亡、坏死、脂滴、线粒体活性和功能性出芽（黏附、面积、退化）的定量评估，本研究旨在阐明复苏方案和溶液组成如何影响囊胚质量和体外发育潜能。

章节摘要

伦理批准

本体外实验研究（及相关的回顾性队列分析，如适用）获得加藤女子诊所机构审查委员会的批准（批准编号25–04，批准日期2025年7月14日）。所有程序均遵循机构和国家级人类研究委员会制定的伦理准则，以及1964年赫尔辛基宣言及其修正案所阐述的原则。已就回顾性研究的使用获得书面知情同意

胚胎特征

共分析了456例玻璃化冷冻囊胚。母龄、父龄、培养时长、内细胞团和透明带外细胞形态以及透明带状态在四组之间无差异（表1）。总体复苏后存活率为98.5%，各组之间存活率无显著差异。

复苏后囊胚动态

对各组非孵出囊胚的复苏后再扩张和收缩动态进行了比较（表2）。复苏培养第一帧中的扩张程度为

讨论

本研究使用基于AI的图像分析和多种定量终点指标，系统比较了新开发的缩短复苏方案与含FA补充与否的常规复苏方案。缩短方案与收缩动态改变、PI阳性细胞增加、线粒体膜电位降低以及体外出芽面积减少相关。虽然FA补充不影响存活率或出芽，但它支持了脂滴的恢复

作者贡献

L.C.和K.E.参与了研究设计、数据收集、解释、撰写和修订。T.M.和N.F.参与了数据收集。A.C.、M.M.和K.K.参与了稿件修订。所有作者均已阅读并批准了稿件的最终版本。

资助

本研究获得瓦伦西亚自治区创新、大学、科学与数字社会部委授予L.C.的资助（西班牙瓦伦西亚）（CIBEPF/2024/083）。

利益冲突声明

M.M.在过去5年中从Merck、Vitrolife、MSD、Ferring、AIVF、Theramex、Gedeon Richter、Genea Biomedx、Fairtility和Life Whisperer获得了个人费用，作为演讲的酬金。其他作者声明不存在利益冲突。

Laura Conversa在米格尔·埃尔南德斯大学学习生物技术，并在瓦伦西亚大学获得辅助生殖硕士学位。她目前是瓦伦西亚大学博士研究生候选人，曾在东京Lato女子诊所进行访问研究，并在西班牙瓦伦西亚IVI生殖中心担任胚胎学家。

关键信息

缩短复苏方案增加了低质量囊胚的坏死，损害了线粒体功能，并减少了体外出芽面积。FA补充

Laura Conversa|Kenji Ezoe|Tetsuya Miki|Nanoha Fujiwara|Tomoko Kuroda|Ana Cobo|Marcos Meseguer|Keiichi Kato